环介导等温扩增在检测肺炎支原体中的临床应用

严春霞，陆伟宏，何国产，闻人庆，钱 颖

1金华职业技术学院医学院医学检验系，浙江金华 3210072金华市人民医院儿科，浙江金华 321000

肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae，Mp)是引起原发性非典型肺炎等呼吸道感染性疾病的常见病原体，通过呼吸道传播，并以婴幼儿多见。支原体肺炎的临床表现不典型，与其他常见呼吸道疾病所致的感染非常相似，仅凭临床症状、病原学诊断，往往难以做出准确的早期诊断[1]。有资料显示肺炎支原体易发生混合感染或者和其他疾病共同存在，临床表现更加不典型，易漏诊，延误病情[2]。因此，为了早期诊断、及时治疗支原体肺炎，快速准确的诊断方法显得颇为重要。Mp的实验室检查中血清学检测依然是目前临床诊断和流行病学调查的主要手段，但检测结果受患儿年龄、病程、机体免疫系统的影响[3- 6]，因此只做单份血清抗体检测只能作为感染的辅助诊断。PCR具有很高的敏感性，比血清抗体能更早地检测出Mp[7]，但是操作复杂、成本高、需要的时间长并需昂贵仪器，不适合各医院开展。环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是2000年由日本学者Notomi等[8]开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件(63 ℃左右)保温30～60 min，即可完成核酸扩增反应。采用肺炎支原体一步法可视化环介导等温扩增试剂盒[9- 10]检测金华市人民医院2016年4月至2018年3月在入院的第1天采集到的108例住院患者的Mp-DNA标本，同时以PCR法和酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法检测同一患者标本，作为对照。以PCR法作为诊断肺炎支原体的金标准，比较该检测方法对Mp感染的临床诊断价值。

材料和方法

材料来源MpPCR检测试剂盒(荧光法)购于上海之江生物科技股份有限公司；Mp-Ab ELISA试剂盒购于杭州艾康生物技术有限公司；引物由上海申能博彩生物技术有限公司合成；其他生化试剂购于Sigma公司。

标本来源随机选取2016年4月至2018年3月金华市人民医院儿科住院患儿咽拭子标本和血清标本108例，均在入院的第1和5天收集样本。年龄为6个月～12岁；病程为≤3周；无哮喘、先天性或慢性肺部疾病，其中病例组73例，符合临床诊断标准并结合PCR法检测结果阳性被诊断为患儿；对照组35例，取自临床和PCR法排除儿童支原体肺炎的其他慢、急性呼吸道感染者。在入院的第1天取2份咽拭子标本和1份血清标本，入院的第5天尽量取2份咽拭子标本和1份血清标本(由于患儿采血困难，所以第2次血清标本只收集到40份)。哺乳期婴儿禁止吃奶2 h后取样。一份咽拭子标本用于MpPCR检测；一份咽拭子标本用于文献[9- 10]研制的肺炎支原体一步法可视化等温扩增试剂盒检测；血清标本用于ELISA法(IgM抗体)检测。

样本处理两份咽拭子标本一份用于PCR法检测，按说明书操作提取基因组DNA，4 ℃保存备用；另一份咽拭子标本用于本研究设计的一步法可视化环介导等温扩增实验，将咽拭子加入到含1 ml TE缓冲液的无菌管中，充分混匀后吸取0.5 ml，加0.5 ml 2×一步法快速提取缓冲液(提取缓冲液为1% 十二烷基硫酸钠，10 mmol/L Tris，0.3 mol/L乙二胺四乙酸，1%交联聚乙烯吡络烷酮，pH 8.0)，混匀后置于90 ℃水浴中，不时颠倒混匀。孵育20 min后，置于冰浴中5 min。4 ℃下保存，用于肺炎支原体一步法可视化环介导等温扩增。血清标本取样后于-20 ℃保存备用。

反应参数PCR法和ELISA法按产品说明书操作；可视化LAMP反应参数为：外引物F3：CACCCTCGG-GGGCAGTCAG；外引物B3：GACCAGCAGGGACAATCAG；上游内引物：FIP(F1C-F2)：ATGATTACAGGCGGTTCGTTTTGTTCAGAGCTGGAGGTTGGCT；下游内引物：BIP(B1C-B2)：ACCACACCAAGTTCACGAGCGTT-TTTCATTCCTTCACCCCGCCC。反应总体积为25.0 μl，包括2.5 μl 10×聚合酶反应缓冲液；4.0 μl MgSO4(25 mmol/L)；1.0 μl dNTPs(15 mmol/L)；1.0 μl 链置换DNA 聚合酶(8 U/μl)；各1.0 μl F3、B3(5 μmol/L)；各1.0 μl 内引物FIP、BIP(20 μmol/L)；1.5 μl 3 mmol/L 羟甲基萘酚蓝；2.0 μl提取的Mp基因组DNA；ddH2O补足至25.0 μl，63 ℃反应60 min观察各管颜色变化，以十六烷基三甲基溴化铵法提取肺炎支原体标准菌株DNA为阳性对照；以ddH2O为阴性对照。

结果判读

MpPCR检测(荧光法)判读标准：阳性对照Ct值应小于38，阴性对照Ct值无数据，否则该次实验视为无效，应检查仪器、试剂、扩增条件等方面的误差。

检测样本Ct值≤38.0者判为阳性；检测样本Ct值>38.0的样本建议重做，重做结果Ct值<40为阳性，否则为阴性。

MpELISA检测结果判读标准：490 nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。实验成立的条件是：阳性对照孔0.6≤OD 490 值≤2.0，阴性对照孔 OD 490 值≤0.2。按下列公式计算标本吸光度/阴性对照吸光度(specimen absorbance/negative control absorbance，S/N)：被检血清 2 孔的平均 OD 490 值/阴性对照血清 2 孔的平均 OD 490 值。如果样品 S/N ≥3，判为阳性；如果 S/N ≤2.5，判为阴性；S/N为 2.5 ～3为可疑，应重测，重测后 S/N ≥3 判为阳性，S/N <3 判为阴性。

一步法肺炎支原体等温扩增判读标准：63 ℃反应60 min后变为天蓝色的为阳性，紫色的为阴性。阴性对照为紫色，若阴性对照为蓝色为无效，应检验检测体系，重测。

统计学处理计算Kappa统计量，评价两种方法检验结果之间的一致性。Kappa值的判定：0.75～1.00 符合很好；0.40～0.74一般符合；0.01～0.39缺乏符合。

结 果

以荧光PCR法作为诊断肺炎支原体的金标准，入院第1天采集的标本经3种检测方法所得结果显示，LAMP方法的敏感度为100%，特异度为94.3%，阳性预测值为97.3%，阴性预测值为100%，阳性似然比为17.5，阴性似然比为0，尤等指数为0.943；ELISA法的敏感度为65.8%，特异度为82.9%，阳性预测值为88.9%，阴性预测值为53.7%，阳性似然比为5.85，阴性似然比为0.41，尤等指数为0.487(表1)。一步法可视化环介导等温扩增与PCR法结果比较，用一致性检验评价这两种方法的一致程度，公式计算Kappa值为0.956，大于0.75，说明肺炎支原体一步法可视化环介导等温扩增与PCR法的一致性好，两者可以比较。肺炎支原体一步法可视化环介导等温扩增与ELISA法结果比较显示，用公式计算Kappa值为0.38，小于0.40，说明肺炎支原体一步法可视化环介导等温扩增与ELISA方法之间缺乏一致性，不可比较(表2)。

入院第5天与第1天3种方法检测40位患者的结果显示，第5天与第1天患者检测结果相同例数最多的是LAMP法，最少的是ELISA法(表3)。

讨 论

早期诊断支原体肺炎，对快速准确治疗有重要意义。目前，诊断支原体肺炎的方法主要有培养法、血清学方法和PCR法。虽然Mp的实验室检测方法多样，但是各种方法均有其优势与不足，目前国内外Mp实验室检测也没有统一的诊断标准。培养法是诊断支原体肺炎的金标准，一旦培养出肺炎支原体即可确诊，但是培养法操作复杂，受样本来源、保存、运输方式、样本中Mp含量以及实验员技术水平等多种因素的影响，诊断Mp感染的灵敏度仅为60%[11]，对临床早期诊断的意义不大，常用于回顾性诊断和研究。有研究比较了培养法、血清学方法和PCR法在支原体肺炎中的差异，一致认为培养法灵敏度、特异性和检出率远远低于血清学方法和PCR法[12]。国内资料显示，ELISA法的敏感性为71%，要高于培养法，但又比LAMP法和PCR法敏感性低得多[12]。ELISA法最好用双份血清，可以提高特异度和敏感度，但由于双份血清比较难获得，所以不适宜用作金标准。根据《体外诊断试剂临床研究技术指导原则》应选择原理相同或接近的作为对照，因本研究采用的是核酸等温扩增原理，市面上尚无同类试剂，因此选择原理接近的MpPCR检测试剂盒作为对照。又因PCR法的敏感度和特异度都比较高，国外也有报道以PCR法为金标准[13]，PCR法的敏感度和特异度都比较高，故而本研究用PCR法作为诊断支原体肺炎的金标准。

表1 入院第1天采集的标本经3种检测方法检测结果的比较(n)Table 1 Results of three detection methods for clinical specimens obtained on the first day of admission(n)

PCR：聚合酶链反应；LAMP：环介导等温扩增技术；ELISA：酶联免疫吸附试验

PCR：polymerase chain reaction；LAMP：loop-mediated isothermal amplification；ELISA：enzyme-linked immunosorbent assay

表2 LAMP法与ELISA法检测结果的比较(n)Table 2 Comparisons of the results of LAMP and ELISA(n)

本研究LAMP法的敏感度为100%，特异度为94.3%，与日本研发的LAMP试剂盒检测的结果基本相符[14- 15]。表1是患者入院第1天检查结果，这个结果显示，ELISA法对早期肺炎支原体诊断的敏感性较低，而LAMP法在早期的诊断上有比较明显的优势。LAMP法与PCR法、ELISA法的比较，证实了LAMP法与PCR法具有可比性，与ELISA法差异明显，不具有可比性。LAMP技术可用于支原体肺炎的早期诊断。

本研究显示用ELISA法第5天为阳性、第1天为阴性的有6例，这可能是因为IgM抗体是在肺炎支原体感染后1周才能出现有关，估计是这6例患者感染的时间太短无法检测出来导致的。第5天为阴性、第1天为阳性的病例有4例，根据国内外相关文献报道，血清特异性抗体 IgM 一般出现于Mp感染后 7 ～ 14 d，3 ～ 4 周达高峰，可持续数月不等[16- 17]，这就无法解释本研究的结果，但实际上IgM抗体的半衰期很短，仅有5 d，它反映的是近期感染。

用PCR法检测第5天为阳性、第1天为阴性的有3例，这可能和样本的采集不当、取样部位太浅有关[18]。第5天为阴性、第1天为阳性的病例有4例，这可能是这几例患者的症状比较典型，用抗生素的时间较早，缩短了MpDNA存在的时间，这个结果也符合Kakuya等[14]的猜测。

用LAMP法检测第5天为阳性、第1天为阴性的有2例，这可能和样本的采集不当有关，或者是在感染的第1、2天，还没办法检测到MpDNA有关。第5天为阴性、第1天为阳性的病例有4例，推测这个原因和PCR法的相同，表明患者得到了及时的治疗，病情已好，所以才检测不到MpDNA。

ELISA检测MpIgM抗体，IgM是机体受肺炎支原体感染时出现的特异性抗体，一般在感染后1周出现，因此，检测结果中ELISA法的假阴性结果偏高。故此法检测的阴性结果不能排除肺炎支原体感染。ELISA法最好在肺炎支原体感染后1周内进行检测或者进行2次检测，以提高检出率，避免漏诊。但双份血清的获得比较困难。本研究显示血清学方法受患儿病程影响较大，特别是对肺炎支原体的早期诊断敏感性较低，不利于患者早期的正确治疗。LAMP法和PCR法检测MpDNA，具有快速、特异、敏感等优点，同时可避免患儿年龄、病程和抗生素治疗的影响，早期诊断支原体肺炎，特别是2岁以下患儿更适合用此法。和PCR法比较，LAMP法的操作更简单，反应时间短，结果判断更直观，对仪器设备、人员操作技能要求低，普通实验室即可开展，特别适合现场高通量检测和基层医疗组织开展检测。

表3 3种方法检测入院第5天与第1天40例患者的结果比较(n)Table 3 Results of 40 patients tested by three methods on the fifth day and the first day(n)

由于LAMP法具有敏感、特异、快速的特点，因此它对提高临床检测效率，灵敏、快速地鉴定临床支原体肺炎有重要意义，对肺炎支原体感染的早期诊治、防治并发症和患者预后评估也有重要价值。综上，本研究显示LAMP法与PCR法比较，两种方法的检测结果符合率高，方法一致性好，LAMP法操作简便，成本低，准确性高，可以代替上述两种方法在临床上使用。