泼河水库底泥中细菌群落的调查

田海军，付朝辉

（信阳农林学院水产学院，河南省渔业生物工程技术研究中心，河南 信阳 464000）

湖泊生态系统在全球及区域地球化学循环中都发挥着重要的作用，而细菌作为有机化合物的主要分解者，调节水体环境，实现水质的净化，并在一定程度上反应水体污染特征及其生态功能演变，因此细菌在湖泊生态系统中的作用日益受到重视，研究细菌群落结构和多样性，对了解群落结构间的动态变化及生态功能、阐明群落与环境，功能间的具体联系以及维护湖泊生态环境具有重要意义，同时也为水产品的安全养殖提供参考[1]。随着分子生物学的理论与技术的发展，本研究将从分子水平上利用16S rRNA基因文库技术分析研究泼河水库底泥细菌群落结构特点[2]。

泼河水库地处大别山北麓，坐落在淮河水系右支泼陂河上，在大别山北麓由深山向浅山丘陵地区延伸的过渡地带，距光山县泼陂河镇3km，流域面积达到222km2，总库容2.35亿m3。泼河水库地理位置独特，南北分别距新县、光山县城各25km，泼河水库风景区地，集豫南山水田园风光于一身，风景区内林木葱郁，层峦叠翠，绿树成荫，多为天然次森林和人工林及散生亚热带经济林，泼河水库渔业资源丰富，目前已发现有20余种经济鱼类，景区自然景观与人文景观相映成趣，是难得的自然、生态旅游和休闲度假好去处。

泼河水库气候处于秦岭淮河气温分界线上，属亚热带向暖温带过渡区，气候温暖，四季分明，阳光充足、雨量充沛、植被茂盛。水库流域上游山峦起伏连绵、峰高谷深、河溪交错。风景区内林木葱郁，层峦叠翠，绿树成荫，多为天然次森林和人工林及散生亚热带经济林。森林覆盖率达75%。野生鸟类有猫头鹰、啄木鸟、山鸡、野鸭、白鹭等二十余种，野生动物有黄羊、野猪、野兔、刺猬和松鼠等，主要特产有茶叶、板栗、银杏、莲子和山野菜。泼河水库渔业资源丰富，目前已发现经济鱼类有30多种，除花鲢、白鲢、青鱼、草鱼四大家鱼外，还有鲫、鲤、黑鱼、桂鱼、银鱼、武昌鱼等，主要商品鱼类为花鲢、白鲢、鲫、鲤和蒙古红鲌，其中野生鱼类黄尾鲴为水库独特商品鱼类。

泼河水库流域面积广阔，春夏季气候温暖湿润，储藏丰富的鱼类资源，盛产淡水鱼类，种类、数量颇多。水底存在大量丰沃的底泥，为研究细菌群落的多样性提供绝佳地点。水质对于鱼的生长至关重要，而底泥中的微生物对水质的变化有举足轻重的作用且细菌群落参与自然界物质循环和能量流动，因此研究泼河水库底泥中细菌群落的多样性和丰富度就尤为重要。

1 材料与方法

1.1 样品底泥的采集

材料为泼河水库在2017年5月份和9月份以及2018年3月份三次在泼河水库底泥，分别为下图1中1#、2#、3#即从上游到下游的三处位置，所有的采样点均使用定位系统GPS进行定位，2017年5月份和9月份以及2018年3月份在泼河水库从上游到下游使用采泥器采集水库表层底泥，另外每个采样点同时采集3个平行底泥样品，然后放在干净的聚乙烯薄膜袋里等待测试[3]。

图1 泼河水库底泥样品采样点Fig.1 Sampling point of mud samples from Pohe Reservoir

1.2 实验方法

1.2.1 底泥样品中细菌总DNA的提取及16SrRNA基因PCR扩增

先完成基因组DNA的抽取，之后利用1%的琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA，按照指定的测序区域，合成带有barcode的特异引物。PCR采用ABI GeneAmp9700型，全部样品按照正式实验条件进行，每个样品3次重复，将同一样品的PCR产物混合后用2%的琼脂凝胶电泳检测，使用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒（AXYGEN公司）切胶回收PCR产物，Tris-HCl洗脱；2%琼脂电泳检测。

1.2.2 高通量测序及数据分析

高通量测序技术是对传统测序一次革命性改变，一次可以对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定[5]。将PCR产物用QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统（Promega公司）进行检测定量，之后按照每个样品的测序量要求，进行相应比例的混合。连接“Y”字形接头，使用磁珠筛选去除接头自连片段，利用PCR扩增进行文库模板的富集，氢氧化钠变性，产生单链DNA片段。由美吉生物科技公司上机测序，得出数据报告，继而进行后续分析。

表1 泼河水库各采样点自然概况Tab.1 Natural overview of each sampling point in Pohe Reservoir

2 结果与分析

2.1 测序情况和多样性指数

OTU（Operational Taxonomic Units）是在系统发生学或者群体遗传学研究中，为了便于分析，人为的给某一个分类单元设置同一个标志，表2中的1-1#、1-2#、1-3#，分别代表第一次采样的 1 号、2 号、3号点，然后以此类推分别是第二次、第三次的采样点[6]。该指数实际反映了本次测序结果是否代表样本的真实情况，由表2可知，Coverage数值较高都在90%以上，Shannon是香浓指数用来估算样品中微生物的多样性指数之一[7]。它与Simpson多样性指数均为常用的反映微生物多样性的指数，Simpson是辛普森指数来估算样品中微生物的多样性指数之一，在生态学中常用来定量的描述一个区域的生物多样性。从本表中看到辛普森指数较低说明测试样品中微生物群落多样性比较高。

图2 泼河泥香浓指数Fig.2 Sprinkling incense index

Shannon指数用于反应样品中微生物群落的多样性（图2），受样品群落中物种丰富的和物种均匀度的影响，Shannon数值越大，就越表明样品中物种越丰富，Shannon指数越小，则表明样品中物种丰富度越低。如图2所示，当随机抽取的测序条数大于5000时，Shannon指数走势平稳，表示其测序得到的数据以及物种覆盖面足够，基本能反应出样品中微生物的基本信息[8]，而且通过表2的Shannon指数可以直观的看出，在不同的样品中底泥细菌的多样性：3-3#＞1-1#＞3-1#＞2-1#＞2-3#＞2-2#＞3-2#＞1-2#＞1-3#。

2.2 群落结构数据分析

为了得到每个OTU对应的物种分类信息，本研究采用了RDP classifier贝叶斯算法对97%相似水平的OTU序列进行分类学分析得出群落结构图（表3），在这个表中为了研究方便将上面表1由属的水平进一步合并到目的水平。由表3可知，一共有67个目，其中Others代表将其他比较少的目合并成一个目。由表2可知，在不同的样品中各种目的细菌所占的比例，12个样品物种组成共覆盖45种，其中厌氧绳菌目Anaerolineaceae_uncultured，黄单胞菌目Xanthomonadales_uncultured为优势种群。

图3的柱形图是将表2的数据转换成柱形图，从中可以直观的不同的底泥样品中不同种类的细菌所占的比例。

表2 测序情况和多样性指数表Tab.2 Sequencing and diversity index tables

表3 细菌群落结构分析表Tab.3 Analysis of bacterial community structure

续表3

图3 群落结构柱形图Fig.3 Community structure column chart

图4 OUT分布韦恩图Fig.4 Venn diagram of OUT distribution

2.3 底泥细菌季度差异情况分析

Venn图用于统计样品间所共有以及独有的OTU数目，由图4可以直观的比较出样品中OTU数目组成的相似性以及重叠情况。现在以不同季度在细菌科的分类水平上进行分析，2017年5月样品中共检测到210个物种，其中特有的物种有5种；2017年9月份共检测出217个物种，其中特有物种12种，和2017年5月份共有的物种一共197种；2018年3月样品中共检测出226种，和2017年9月份共有的物种一共有200种。同时也可以看出在这三个不同的时间段内共有的物种有192种，其中第一次和第二次和第三次所特有的OTU数目分别为5、12、18，第三次采样的底泥中特有的OTU最多，预示着有比较多的特有细菌。

2.4 底泥细菌空间差异分析

图5是将三次采样同一个位点的放在一起，来分析同一个采样点在不同的时间段里细菌种类组成的特点。由图5可知1#采样点和2#采样点在三个不同的时间段内共有的细菌种类有201种，1#采样点特有细菌种类16种，2#采样点特有种类12种，3#采样点特有细菌种类10种，三个采样点共有细菌种类189种。2.5 理化指标分析

典范对应分析方法主要是用于环境变量和物种帆布关系的解析，能很好地帮助我们研究由定性变量的交互汇总表来揭示变量间的联系[10]，交互表的信息以图形的方式展示。常用于多个类别的定类变量，可以揭示同一个变量的各个类别之间的差异，以及不同变量各个类别之间的对应关系，多用于两个或者多个定类变量。

可以从各个采样点的中心点向任意的一项理化指标所在的向量做垂线，例如如果从图6所有的9个采样点做垂线到SD所在的向量，可以看出垂点越靠近SD（透明度）向量正方向的表示这个采样点和 SD 的相关性越强，分别是 2-2#＞1-2#＞3-2#＞2-1#＞1-1#＞1-3#＞3-3#＞2-3#＞3-1#，另外从各个向量的夹角来看，当从中心向任意两个点做向量的时候，如果夹角是锐角的话那就表示这两个指标具有相关性，锐角越小说明相关性越大，如pH和T的夹角是锐角，而且角度比较小那么说明这两个指标是具有相关性的，同样T和DO夹角是锐角也有比较强相关性，而SD和TP（总磷）在图中可以看到夹角为钝角，那么说明SD和TP这两个指标之间没有相关性，第三从各个指标距离中心点的位置看，越靠近中心，越没有特征，越远离中心，说明特征越明显，从图中可以看到TP距离中心点最远，说明TP特征最强也就是说TP对这九个采样点最重要，而COD（化学需氧量）距离中心最近说明COD在这9个样品中特征不明显。

3 讨论

底泥微生物群落是湖泊生态系统的重要组成部分，是促进生态养殖系统新陈代谢的重要参与者，底泥细菌的存在对于净化水体，改良池底生态环境，疾病防控等方面都具有重要的作用。我国目前对底泥中细菌的研究也不多。研究底泥细菌的情况，对了解底泥细菌的组成和种类分布，了解群落结构间的动态变化及生态功能，维护湖泊生态环境具有积极意义。泼河水底存在大量丰沃的底泥，为研究细菌群落的多样性提供绝佳地点。水质对于鱼的生长至关重要，而底泥中的微生物对水质的变化有举足轻重的作用且细菌群落参与自然界物质循环和能量流动。不同时间段由于湖泊生态系统的选择作用，泼河水库底泥细菌群落结构是有变化的。

（1）从泼河水库样品的测序情况来看，所有样品的香浓指数都比较高，辛普森指数都较低，这些共同说明了泼河水库在2017年5月、9月和2018年3月时间段内泼河水库底泥中细菌群落具有很高的多样性细菌的群落组成很丰富。

（2）泼河水库底泥细菌群落结构组成在检测的三个时间段内是有较大差异的，在2017年5月采样的样品中特有的物种有5种所占样品中比例为5%，2017年9月份特有物种12种所在样品中比例为4.8%，2018年3月特有物种13种所占比例7.3%，说明在不同的时间段内泼河水库底泥细菌群落发生了演替。在时间分布上，泼河水库底泥细菌群落数量最高值出现在2018年3月份，最小值出现在2017年5月份，而在王晓丹等[11]在北京密云山水库的研究中，7月份细菌总数达到最大值，这可能是受到研究水域的纬度和其它物理因素的影响，另一方面，可能是水库生态环境的不同以及细菌种类差别导致了群落数量最高值出现时间的差别。

（3）从典范对应分析中得知，泼河水库中的DO和T、T和pH、DO和TP，指标之间具有相关性且关系密切互相影响，而SD和COD指标之间相互关系最弱几乎没有，最后TP是对细菌的组成最重要的指标。钱玮等研究发现总氮（TN）、总磷（TP）、总有机碳对太湖底泥细菌群落结构的影响最大，其次是总磷（TP）和总有机碳（TOC）[12]。

（4）研究发现，在2017年5月、9月和2018年3月三次采样三个时间段内在科的分类水平上共有192种细菌，所占比例为77.4%，说明泼河水库中至少七成的细菌是长期固定不变的。这说明泼河水库底泥拥有稳定的特性，考虑到底泥细菌生活的特殊环境，即远离表层水体，以及水深程度的相关因素，底泥细菌生长环境远离表层，不容易受到水体水质变化的影响。泼河水库3个采样点12个样品物种组成共覆盖45种，其中厌氧绳菌目Anaerolineaceae_uncultured，黄单胞菌目Xanthomonadales_uncultured为优势种群。成敏玲研究东湖不同富营养化区域底泥的优势种群，官桥湖区为脱氯单胞菌属Dechloromonas、Desulfatiglans和硫杆菌属 Thiobacillus，海洋世界区为硝化螺菌属Nitrospira[13]。曲艳娇等于2009至2010年对海浪河河夹村段水体及底泥中细菌组成与时空分布进行研究，结果表明，该流域分离出的细菌隶属于5个细菌菌属，其中微球菌属Micrococcus是优势菌属，其次是假单胞菌属Pseudomonas和动胶菌属Zoogloeaitzigsohn[14]。张东升等对碧流河水库2008年4—11月水体细菌生物量为（4.94±2.37）mg·L-1，细菌密度最高值出现在 5月份下游右侧中层，细菌数量水平、垂直分布无规律[15]。厌氧绳菌、黄单胞菌、硫杆菌属为革兰氏阴性，厌氧菌数量较多，说明含氧量低不利于好氧细菌的生长和繁殖，不能进行光合作用的菌属，因为底泥一般在水中较深处，阳光无法照射，在有合适的无机电子供体时，能同化有机物，同时可以降低亚硝酸盐，硫化氢含量，分解有机物，可作为无机营养菌。泼河水库存在大量淡水鱼类，泼河水库渔业资源丰富，目前已发现经济鱼类有30多种，厌氧绳菌和黄单胞菌等底泥细菌的大量存在为鱼类改善环境条件，因此具有十分必要的存在。