一例猪链球菌的分离与鉴定

李天芝，于新友

（山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600）

猪链球菌（Streptococcus suis,SS）是常见的猪病原菌，根据荚膜抗原的不同可分为35种血清型（1～34型及1/2型），各血清型间交叉保护力差。其中最常见、公认对猪危害最大型的血清型是1型、2型、1/2型、7型、9型和14型[1]，尤其是2型，流行最广、致病性最强，可感染牛、羊、猪、鸡、鸭、鹅等多种动物，也可以感染人，引起人的链球菌病，是一种重要的人兽共患性病原菌[2]。由猪链球菌引起的疾病称为猪链球菌病，该病在世界范围广泛流行，各品种和日龄猪均可发生，1～3月龄仔猪高发，临床表现类型多样，如败血型、关节炎型、脑膜炎型和淋巴结脓肿型等[3]。猪链球菌病可通过呼吸道、消化道等多种途径传播，也可通过破损的皮肤和黏膜传播。猪链球菌病是当前危害我国养猪业最严重的一种细菌性疾病之一。

2018年8月，鲁北地区某猪场断奶仔猪不明原因死亡，送鲁北兽医诊断中心诊断，询问畜主知猪死前倒地，体温高达41℃，有四肢划水神经症状，观察死亡猪只，皮肤有大小不一的紫斑；剖检可见死亡猪血液凝固不良，脾脏肿大、呈暗黑色，肝脏肿大、边缘钝圆、质脆，全身淋巴结肿大，腹腔内有大量黄色液体，并有纤维蛋白渗出，肺脏肿胀，有出血点，脑膜出血，脑脊液浑浊，关节肿大，关节腔内有脓性分泌物。笔者无菌采取病死猪的肝、脾、关节液及脑等作为病料，进行细菌分离培养、形态学观察、染色镜检、生化试验、PCR鉴定、致病性试验及药敏试验，确定此分离菌是猪链球菌，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 病料采集

病死猪剖检后，无菌采集肝脏、脑、关节液等作为病料。

1.2 试验动物

15只18～22g清洁级健康昆明系小鼠购自山东省实验动物中心；4头30日龄仔猪购自滨州周边猪场。

1.3 试剂

草酸铵结晶紫、革兰氏碘液、石炭酸复红染液由山东绿都生物科技有限公司质量监察提供；胰蛋白大豆琼脂（TSA）、胰蛋白大豆肉汤（TSB）购自北京中海生物科技有限公司；新生牛血清购自天津康源生物技术有限公司；药敏纸片及生化试验用各种试剂及糖发酵管等均购自杭州微生物试剂有限公司；Premix Tag、DL 2 000 DNA Marker、细菌基因组提取试剂盒、高纯质粒小量制备试剂盒和多功能DNA纯化回收试剂盒均购自北京百泰克生物科技有限公司；pMD18-T载体购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.4 PCR引物设计

根据GenBank登录得的猪链球菌谷氨酸脱氢酶（GDH）基因保守序列，设计猪链球菌检测通用引物，引物序列分别为：GDH-F：5'-AAGTTCCTCG GTTTTGAGCA-3'，GDH-R：5'-CGGAGGCGTTTGTA TTGA-3'；扩增目的基因片段大小约242 bp，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.5 细菌分离、培养

将无菌采集的猪肝、脾、关节液及脑等病料样品，超净台内用火焰烧其表面除菌，剪切新鲜创口，使用冷却的接种环蘸取病料，分别划线接种于麦康凯营养琼脂培养基、普通营养琼脂培养基、含4%新生牛血清的TSB固体平板培养基，37℃培养18 h，观察菌落形态，挑取可疑菌落涂片，革兰氏染色镜检。

1.6 生化鉴定

分离的链球菌传代纯化后，挑取单菌落接种细菌生化微量鉴定管，进行糖发酵试验及其它生化试验，37℃培养24 h观察结果。

1.7 药敏试验

采用纸片琼脂扩散法检测分离菌的药物敏感性，挑取分离菌单菌落致密划线接种于4%新生牛血清的TSB固体平板，用无菌镊子夹取药敏纸片分别贴于培养基表面，各纸片距离要相等。纸片与纸片的中心距离不小于24mm，纸片与平皿边缘不少于15mm，并轻压使其紧贴平皿表面，平板倒置于37℃温箱中，培养18 h。观察结果，测量抑菌圈直径大小。

1.8 PCR 鉴定

取培养的分离菌菌液，按基因组DNA试剂盒说明书提取细菌基因组DNA作模板，以GDH-F和GDH-R进行PCR扩增。反应体系如下：Premix Tag 10 μL，引物 GDH-F 和 GDH-R 各 1 μL（10 pmol/L），DNA 模板 2 μL，加水补足至 20 μL。扩增反应程序：预变性95℃ 5 min，变性94℃ 20 s，退火52℃20 s，延伸72℃20 s，35个循环。PCR产物回收后，与pMD18-T载体连接，转化DH5α，将初步鉴定为阳性的重组菌送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.9 致病性试验

1.9.1 小白鼠致病性试验 15只小白鼠，分成两组，试验组10只，分别腹腔接种细菌分离培养物0.2 mL（4×108CFU/mL），对照组 5 只，分别腹腔注射0.2 mL TSA液体培养基。注射后小白鼠隔离饲养，观察发病及死亡情况。取死亡小鼠的肝脏、脾进行细菌分离。

1.9.2 动物回归试验 30日龄断奶仔猪4只，平均分成两组，试验组耳静脉注射2 mL分离菌（含2×108CFU/mL）液体纯培养物。对照组注射2 mL TSA液体培养基，观察仔猪发病及死亡情况。剖检死亡猪只，取肝脏、脑等分离细菌。

2 结果与分析

2.1 菌落形态及镜检结果

麦康凯琼脂平板和普通营养琼脂平板上无细菌生长，TSB固体平板培养基表面有光滑、圆形、边缘整齐、灰白色、半透明的菌落生长，菌落直径大小0.3～1.0 mm，挑取单菌落，革兰氏染色、镜检，可见革兰氏染色为阳性球菌，少数长链，多数呈3～5个短链或单个存在。

2.2 生化试验结果

生化试验结果显示,分离菌符合猪链球菌的生化特性，提示分离到的确为猪链球菌。生化试验结果见表1。

表1 分离菌的生化反应结果

2.3 药敏试验结果

药敏试验结果见表2，分离猪链球菌对头孢噻呋、万古霉素、红霉素、庆大霉素、克林霉素、克拉霉素高度敏感；对氟苯尼考中度敏感；对阿莫西林、环丙沙星、强力霉素、恩诺沙星、大观霉素耐药。

表2 分离菌株的药物敏感性试验结果

2.4 动物致病性试验结果

2.4.1 分离菌对小鼠的致病性 试验组小白鼠于感染后12 h开始死亡，至48 h全部死亡。剖检死亡后小白鼠可见肝脏、脾脏肿大，膀胱黏膜充血，肾脏肿大，切面有小出血点，胸腔内有积液，用肝脏及心血涂片，革兰氏染色镜检，发现有大量单个、成对或呈短链状革兰氏阳性球菌。对照组小白鼠未见异常。

2.4.2 动物回归试验 攻毒组仔猪在攻毒10 h后均精神沉郁，48 h后其中1头死亡，另1头在72 h内死亡，观察死亡猪只胸腹下及四肢皮肤有出血点或出血斑，剖检可见猪血凝不良，全身淋巴结肿大、出血，心包有积液，心内膜出血；肾脾脏肿大，呈暗红色，胸腔、腹腔有纤维性炎。肝脏触片，革兰氏染色镜检可见有大量单个或呈短链状的革兰氏阳性球菌，对照组猪只则无任何临床症状出现。

2.5 PCR 鉴定

PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定大小为242 bp，与预期结果一致。结果见图1。

图1 分离菌PCR鉴定

目的基因回收后，连pMD18-T载体，转化DH5α，采用PCR方法筛选阳性菌落，同时将含有插入片段的阳性质粒送去测序。将测得序列与GenBank中的猪链球菌进行同源性比较，与猪链球菌GDH基因同源性为100%。

3 讨论

猪链球菌在世界上广泛分布，是猪场常在菌。猪链球菌病在猪场发病率高，可通过呼吸道、消化道及损伤的皮肤和黏膜等多种途径传播。当猪饲养管理不善时更易发病，也容易与其它疾病发生混合感染或作为其它疾病的继发病，已成为困扰养猪业发展的常发病。随着我国养殖行业禁抗呼声高涨及人们对食品安全的关注，笔者认为未来对待链球菌等细菌性疾病的防控策略应逐渐由抗生素防控，转变为生物安全综合防控措施为主、疫苗防控为辅的策略。本研究从一发病猪场成功分离到一株强致病性的猪链球菌，并进行初步鉴定，为猪链球菌病新型疫苗的研制开发奠定基础。

本试验分离的一株猪链球菌在6.5%NaCl肉汤中不生长，V-P试验阴性，淀粉酶试验阳性，能发酵葡萄糖、果糖、半乳糖、山梨醇、麦芽糖、柳醇、水杨素、蔗糖、海藻糖和乳糖，不能发酵菊糖、木糖、鼠李糖、甜醇、阿拉伯糖、肌醇、棉子糖和卫矛醇，符合猪链球菌的生化特征。该菌可使试验组小鼠48 h内全部死亡，回归接种猪后，也能致死猪，表明该分离菌具有很强的致病性。GDH基因是猪链球菌35种血清型共有的基因，在细菌能量代谢过程中发挥着重要的作用[4]，不同血清型猪链球菌GDH基因保守性较强，可作为猪链球菌种属分子诊断的靶基因，本试验根据猪链球菌GDH基因设计引物，对分离菌进行扩增，电泳检测可见预期目的条带，测序结果显示与GenBank登录的猪链球菌类GDH基因的同源性为100%。药敏试验结果显示，分离的猪链球菌对头孢噻呋、万古霉素、红霉素、庆大霉素、克林霉素、克拉霉素高度敏感；对氟苯尼考中度敏感；对阿莫西林、环丙沙星、强力霉素、恩诺沙星、大观霉素耐药。对分离的猪链球菌不敏感的抗生素为猪场内常用抗生素，说明猪场因长期使用这些抗生素而产生了耐药性。另外，笔者查阅了不少文献资料发现，猪链球菌药敏试验结果并不统一，这可能跟猪场抗生素滥用导致的细菌耐药性有关。下一步打算开展分离菌的血型分型、免疫原性等研究，为更好防控该病选用正确的疫苗及新型疫苗研制奠定基础。

建议猪场发生链球菌病等细菌性疾病时，最好分离细菌，并进行药敏试验，选取几种敏感性抗生素轮换或穿梭用药，提高药物治疗效果，有针对性地用药，避免盲目用药造成的细菌耐药性问题。另外链球菌病也常与其它猪病混合感染，临床诊断时，一定要分清主要疫病和次要疾病，做到有针对性地治疗，控制猪的原发性疾病。

任何疾病都要遵循防重于治的原则，猪链球菌病也一样[5]，平时要加强饲养管理，饲喂优质饲料，圈舍保持适宜环境，加强清洁消毒工作，避免猪群打斗，出现外伤，做好猪场生物安全措施。有条件的要接种疫苗防控，选用含多种血清型菌株疫苗，这也是猪场未来链球菌病防控的方向。