景天三七主要活性成分与土壤、气象因子的相关性

任平 ，付博，刘晨，阮祥稳 ，王远征，李英梅*

1. 陕西省生物农业研究所，陕西 西安 710043；2. 陕西省酶工程技术中心，陕西 临潼 710600

景天三七（Sedum aizoon L.）为景天科植物，具有耐旱、耐寒、耐盐碱，适应性强等特征，在四川、陕西、宁夏、青海等地种植广泛（杨艳俊等，2014）。景天三七茎叶中含有丰富的景天庚糖、谷甾醇、生物碱及黄酮类等活性成分，具有宁心平肝、降血脂、降血压和预防血管硬化等功效（王娜等，2011；王鸿飞等，2013；刘艳杰等，2016），已被纳入江苏省中药材体系，可作为药食两用植物，是陕西省目前农村产业结构调整的新优特菜品种之一。

环境生态因子对药用植物生长发育、产量和品质具有很大的影响，不同产地药用植物的活性成分存在较大差异，适宜的生态环境条件有利于中药材的优质高产（刘晓慧等，2015；董鹏鹏等，2016；范菊娣等，2016），阐明药用植物化学成分的累积与生态因子的关系对生产实践具有重要意义。有关中药材有效成分与环境因子的相关分析表明，土壤对枸杞（Lycium barbarum）多糖含量具有重要影响，其中全磷元素是影响枸杞多糖含量的主要因子，气象因子次之（张晓煜等，2003）；而纬度是影响滇重楼（Paris polyphylla var. yunnanensis）根皂苷含量最主要的决策因子，表明滇重楼根皂苷含量具有一定的地域性特征，适宜种植在土壤有机质和粘粒含量高，土壤pH中性的土壤上（何忠俊等，2016）；日照时数、海拔和降水量是影响羌活（Notopterygium incisum）化学成分的主要因子（黄林芳，2013）；温度对人参（Panax ginseng）皂苷活性成分累积起主要作用（谢彩香等，2011；贾光林等，2012）。这些都表明了植物化学生态型的形成和分化与其所在的地理环境差异有关。

陕西是景天三七的高度适生区（周佩等，2015），该植物在陕西西安、洛南等地均有种植，但由于各种植区的气候和土壤环境等各种自然因素因素的影响，景天三七的生物活性成分含量差异较大。目前，对于景天三七的研究多集中于其活性成分的提取（杨艳俊等，2015；张兴桃等，2017）、栽培（徐冬梅等，2016；王一鸣等，2018）及药理研究（许智超等，2015）等方面，对于不同生态环境下景天三七活性成分含量差异及其与生态因子的耦合关系尚缺乏深入系统研究。

为了更好地探索陕西关中平原中部（西安市鄠邑区）、关中平原东部（渭南市大荔县）和陕南秦巴山区（商洛市洛南县）不同生态区域下的景天三七品质差异，本研究以景天三七重要生物活性成分生物碱、谷甾醇、总黄酮及景天庚糖为指标，探讨不同生态条件下景天三七生物量的形成和有效成分积累与生态因子的相关性，揭示影响景天三七主要活性物质的关键生态因子，阐明生态因子对植物成分积累的影响，以期为其引种栽培、高效生产和资源利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计与样品采集

2017年4月1日-4月6日，精选相同种源的优质景天三七种苗，在西安市鄠邑区、渭南市大荔县和商洛市洛南县 12个试验样地扦插栽种。栽培样地土壤为略带沙性壤土，肥力适中，灌排便利，统一规范人工栽培管理。扦插前整平细作地块，均不施用肥料。每个试验区面积约100 m2，起垄定植，垄高25 cm，株行距25 cm×30 cm，逢春夏特别干旱时人工灌水少量，但仅以减缓旱情为度。6月中旬和8月中旬人工锄草2次，全生长期均无农药和化肥喷施，减少人为因素干扰。2017年8月25日-8月31日采集实验样品。在每个试验区中，统一选择长势均匀的健康植株，按照“X”布点挖取 5株，重复3次，除去根部，保留植株上部茎叶部分，清洗后置于-56 ℃、10 Pa条件下进行冷冻干燥30 h。干燥样品粉碎过40目筛，密封待用。采集景天三七样品的同时采集土壤样品，按照“X”布点，使用采样器采土，用四分法缩分，封装于自封袋中。手持GPS获取试验区纬度、经度以及海拔地理信息（见表1）。

1.2 样品化学成分的测定

1.2.1 总黄酮含量测定

景天三七茎叶中总黄酮含量测定采用 DB43/T 476—2009（言剑等，2009）进行。

1.2.2 总生物碱含量测定

景天三七茎叶中总生物碱含量测定参照卢琴芳等（2014）的方法。

表1 景天三七试验点地理信息Table 1 Geographical information of Sedum aizoon

1.2.3 谷甾醇含量测定

景天三七茎叶中谷甾醇含量的测定参考Abdallah et al.（2017）的方法。精确称取过40目筛的样品1.50 g，加入氢氧化钾乙醇溶液6 mL后加塞密封，剧烈振摇30 s，置于70 ℃的水浴锅中皂化1 h，每隔10 min振摇1次，冷却后加超纯水1 mL和正己烷5 mL，密封后剧烈振摇30 min，静置，将上层（正己烷层）液体转移至25 mL小烧杯中，水层再用正己烷萃取3次，每次5 mL，合并正己烷提取液，待溶剂挥发完全，残留物加甲醇溶解，定容于10 mL量瓶中，过0.45 µm微孔滤膜，备用。

液相色谱条件：Agilent 1200型高效液相色谱仪；色谱柱：Agilent Extend-C18（150 mmt Exten，2.6 µm）；流动相：溶剂A（0.1%乙酸水溶液），溶剂B（乙腈）。柱温：50 ℃；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：240 nm；进样量为20 µL。

质谱条件：Agilent 6410三重四极杆质谱仪，离子源：电喷雾源（ESI）；扫描范围：200-500 m·z-1；干燥气为N2，体积流量：12 L·min-1；雾化气压力：15 psi；干燥气温度：350 ℃；毛细管电压：4000 V；Fragmentor：135 V；CE：40 V。依据外标法，将标准谷甾醇浓度与其峰面积对比检测样品中的峰面积（图1），经换算得到样品中的谷甾醇含量。

1.2.4 景天庚糖含量测定

样品处理参照Wamelink et al.（2007）的方法。精确称取过40目筛的样品2.00 g，加入10倍体积的80%乙醇溶液在常温下浸提24 h，然后过滤，在50 ℃下使溶剂挥发完全。加入20倍体积的蒸馏水，在50 ℃下搅拌提取4 h，过滤后，重复2次，合并3次滤液，2000 r·min-1离心分离，减压浓缩。浓缩液加入Sevage试剂去除游离蛋白（Sevage试剂为4∶1的氯仿正丁醇），然后透析（自来水透析48 h，蒸馏水透析24 h，透析袋规格为8000-10000 Da）。将袋内液取出，加入无水乙醇至醇质量分数为70%，在4 ℃冰箱中静置过夜，离心分离得沉淀物。加入蒸馏水使沉淀物溶解，定容至100 mL。

图1 谷甾醇色谱图Fig. 1 Chromatogram of sitosterol samples

液相色谱条件：参照 Huck et al.（2003）和Wamelink et al.（2005）的方法。采用Waters高效液相色谱仪对样品中景天庚糖含量进行测定，取提取液 20 μL，注入色谱仪，色谱条件：色谱柱为UltrahydrogelTM500（7.8×300 mm）；流动相：蒸馏水；流速：0.6 mL·min-1。紫外和示差检测器，Millennium-32色谱工作站，柱温：35 ℃；示差检测器温度：35 ℃。依据外标法，将标准景天庚糖浓度与其峰面积对比检测样品中的峰面积（图2），经换算得到样品中的景天庚糖含量。

1.3 土壤样品测定

土壤碱解氮采用碱解扩散法测定；有效磷采用碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法，分光光度计测定；速效钾采用 1 mo1·L-1乙酸铵浸提-火焰光度法测定（鲁如坤，2000）。

图2 景天庚糖色谱图Fig. 2 Chromatogram of sedoheptulose samples

土壤样品无机元素测定采用感耦等离子体原子发射光谱方法（JY/T 015—1996）测定。土壤样品室内自然晒干，研碎过100目筛，精密称取1.2 g样品置于30 mL聚四氟乙烯（PTFE）烧杯中，加少量水湿润，再加5 mL盐酸，盖上PTFE盖，中温加热30 min，加2.5 mL硝酸，继续微沸加热至硝酸分解完毕，加7 mL氢氟酸，0.5 mL高氯酸，盖好并加热，待溶液基本澄清后，将盖取下，140 ℃高温至高氯酸全部挥发，取下，冷却，加入约1.7 mL盐酸和少量水，加热至其完全溶解后，用水定容至25 mL，取约20 mL溶液过0.22 µm滤膜，进ICP电感耦合等离子体发射光谱仪分析，测定全量铜、锌、锰、铁、钙和镁元素含量。测定结果见表2。

1.4 气象数据的获取

试验期间气象数据来源主要依据中国气象科学数据共享中心平台（http://cdc.cma.gov.cn）的“中国地面气候资料月值数据集”和陕西省农业局的当年气象资料和基础地理信息栅格数据及衍生数据，主要获取景天三七苗移栽后至当年采收的生长时间段（4-8月）的降水量、大气压力、风速及日照时数。采用PH小型气象站进行2017年4-8月大气温度及15 cm地温数据的采集，结合相关研究资料共选取10个指标，即4-8月的平均气温（MT）、平均最高气温（MHT）、平均最低气温（MLT）、4月均温（AMT）、7月均温（JMT）、平均日温差（MTD）、平均地温（MGT）、月均降水量（MRF）、平均气压（WVP）、平均风速（WS）及累积日照时数（SD）（见表3）。

1.5 数据分析

运用SPSS 17.0软件对景天三七活性成分、试验点土壤养分及气象因子进行方差分析、相关性分析，采用SPSS 17.0软件中的主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）法对景天三七引种区土壤养分含量进行分析；采用Canoco 4.5软件中的冗余分析（Redundancy Analysis，RDA）法分析茎叶中活性成分含量与生态因子之间的相互关系。显著度水平设为0.05。

2 结果与分析

2.1 景天三七茎叶中活性成分含量分析

由表4和表5可知，不同试验区景天三七茎叶中的生物碱、谷甾醇、总黄酮和景天庚糖的含量存在差异。LN3（洛南墨子沟）景天三七生物碱含量（7.23 mg·g-1）显著高于其他产地的生物碱含量，DL2（大荔西堡）的生物碱含量最低，为 5.82 mg·g-1；大荔县 4个试验点谷甾醇的含量显著高于其他试验点谷甾醇的含量，其中以DL2的谷甾醇含量最高，为3.91 mg·g-1，洛南县4个试验地谷甾醇的含量显著低于其他产地谷甾醇的含量，其中LN1（洛南灵口街村）的谷甾醇含量最低，为2.37 mg·g-1；洛南县 4个试验点总黄酮含量显著高于鄠邑区和大荔试验点总黄酮含量，其中以 LN2（洛南杨庄村）的总黄酮含量最高，为10.08 mg·g-1；大荔4个试验点景天庚糖的含量显著高于其他产地，其中以 DL3（大荔雨林村）的含量最高，为 13.27 mg·g-1，LN4（洛南西塬村）的景天庚糖含量最低。景天三七活性成分含量的相关分析结果（表6）表明，景天三七景天庚糖含量与谷甾醇之间呈极显著正相关（r=0.751）；与生物碱、总黄酮呈不显著负相关；总黄酮与生物碱、总黄酮与谷甾醇及生物碱与谷甾醇之间均呈不显著负相关性。表4显示，不同试验点景天三七各活性成分均存在较大的差异，以总黄酮变异系数最高，为 39.67%；其次为谷甾醇和景天庚糖的含量变化，变异系数分别为 16.72%和10.29%；生物碱的变异系数最小，为7.15%。这反映了不同试验地景天三七之间的多样性分化，产地不同会造成景天三七化学组成上的差异。

表2 土壤养分质量分数Table 2 Soil nutrition content of 12 experimental sites

表3 12个试验点的气候因子Table 3 Meteorological factor of 12 experimental sites

表4 景天三七活性成分含量分析Table 4 Comparison of active component in Sedum aizoon L.

表5 产地间活性成分单因素方差分析Table 5 One-way ANOVA among active components from different areas

表6 景天三七活性成分间的相关关系Table 6 Correlation analysis for the content of active components in Sedum aizoon L.

2.2 景天三七产地土壤养分含量

由图3可知，分析提取3个主成分，其中主成分1的方差贡献率为53.81%，主要由速效钾、锌、锰、钙、镁组成；主成分 2的方差贡献率为21.34%，主要由铜和铁组成；主成分 3的方差贡献率为11.34%，主要由碱解氮组成。由表7可知，土壤养分在鄠邑、大荔及洛南 3个生态区之间存在显著差异，主要表现为大荔的速效钾、锌、锰、钙、镁显著高于鄠邑和洛南，鄠邑区土壤中铜、铁含量较高。鄠邑、大荔及洛南 3个试验区土壤养分各元素含量差异较大，且主要表现为钙、镁和锌的差异。

2.3 景天三七活性成分含量与土壤因子的相关性

不同产地景天三七4种活性成分含量与土壤因子的RDA排序见图4。结果表明，第一和第二主轴分别解释了景天三七活性成分变量的85.2%和9.3%方差。图中箭头越长，表示对景天三七活性成分含量的解释量越大，箭头间角度的余弦值表示了变量之间的相关性。景天三七中景天庚糖和谷甾醇含量与土壤中钙（F=7.49，P=0.006）呈显著正相关，与速效钾、镁、锰、锌呈正相关，与碱解氮、有效磷呈不显著负相关性，生物碱对生态因子的响应与谷甾醇和景天庚糖总体相反，与钙元素含量呈显著负相关。总黄酮含量与土壤中锰、锌、有效磷、镁、钙呈正相关，与铜（F=16.81，P=0.002）、铁（F=4.03，P=0.030）显著负相关性。可见土壤养分中钙对景天三七中活性成分含量的影响最大，其次为速效钾、锰、碱解氮和镁。

图3 景天三七试验点土壤养分PCA分析载荷图（A）和得分图（B）Fig. 3 PCA load diagram for soil nutrient in the origins of Sedum aizoon L.

表7 土壤养分单因素方差分析Table 7 One-way ANOVA between inorganic elements in soil

图4 景天三七活性成分含量与土壤因子RDA排序Fig. 4 RDA of the active components and soil variables

2.4 景天三七活性成分含量与地理气象因子的关系

不同产地景天三七4种活性成分含量与地理气象因子的RDA排序（如图5所示）结果显示，第一和第二主轴分别解释了景天三七活性成分的88.2%和9.3%方差。影响景天三七活性成分含量的主要气象因子是日温差（F=53.44，P=0.002）和平均气温（F=31.04，P=0.002），其次依次为经度、平均最高气温、日照时数、纬度、海拔、7月均温、平均地温和4月均温。景天三七中景天庚糖和谷甾醇含量与平均气温呈显著正相关，与日照时数、水蒸气压及平均地温、平均最高气温、4月均温以及7月均温等温度因子呈正相关，与降水量呈负相关。生物碱含量对气象因子的响应与谷甾醇和景天庚糖总体相反，与降水量呈正相关，与日照时数及温度因子呈不显著负相关。景天三七中总黄酮含量与日温差呈显著正相关，与降雨量、海拔、经纬度、日照时数呈正相关，与多个温度因子呈负相关。

图5 景天三七活性成分与地理气候因子RDA排序Fig. 5 RDA of the active components and geographical climatic factor

3 讨论

药用植物的活性成分多为次生代谢产物，次生代谢物质在植株体内的合成和累积受遗传基因和环境因素的双重调控。地理位置因素通过影响光、热量、水分等环境因子的空间分布间接影响着植物的生长，土壤元素通过植物根系吸收影响植物生长及生理代谢活动，进而影响植物体内有机物质的分布和活性成分的累积（张晓煜等，2003；何忠俊等，2016）。本研究通过对3个引种生态区12个试验点景天三七4种活性成分含量分析发现，产地不同会造成景天三七化学组成上的多样性分化。在本研究的三个引种区内，景天庚糖、总黄酮含量均随研究地点的不同表现出明显的差异，且总黄酮的差异最大（变异系数最高）。然而，三个引种地的景天三七生物碱含量变化不大，表明生物碱含量受土壤和气候因子的影响较小。此外，景天庚糖含量、谷甾醇含量之间具有正相关关系，表明景天三七的化合物间的含量也存在着一定联系，值得进一步研究。

土壤影响着植物矿质营养的吸收、水分和空气的供给，药用植物活性成分累积与土壤元素含量有极大相关性（银玲等，2013）。本研究表明，土壤元素中钙、铜、铁对景天三七活性成分含量影响较大。景天三七中景天庚糖和谷甾醇含量与土壤中元素钙呈显著正相关，表明在一定浓度范围内随着土壤钙元素含量增加，有利于提高植物光合速率，促进景天庚糖、谷甾醇合成途径中关键酶活性大幅度增强，提高植株中景天庚糖和谷甾醇的代谢合成和积累；景天三七中总黄酮含量与土壤元素铜、铁呈显著负相关，与锰、锌、有效磷、镁、钙呈正相关，表明随着土壤元素中铜、铁含量的增加，黄酮类成分合成途径中相关酶活性可能受到抑制，减少了黄酮类化合物的合成和累积。但土壤因子对植物活性成分的影响并不是绝对的，主要是因为土壤中的钙、铜、铁含量不是单一变量，且具有一定的变化范围，植物活性成分的分化和累积也受到其他土壤元素和生态因子的影响。因此，土壤中钙、铜、铁含量显著影响着景天三七中有机物质的分化，而其他土壤因素镁、锰、锌、碱解氮、速效钾、有效磷则影响了景天三七活性成分的合成量。在生产实践中，在一定范围内增加土壤中钙、镁、锰、锌的含量，有利于增加景天三七中景天庚糖、谷甾醇和总黄酮的含量，尤其以景天庚糖、谷甾醇含量增加较为显著。

经度、纬度和海拔综合反映着植物生长空间的光照、温度和水分，是影响植物生长发育和分布的间接因素。本研究结果表明，日温差和平均气温对景天三七中活性成分含量的累积影响最大。气温影响着植株体内酶系统的活性和催化反应的速度，从而影响植株活性物质的合成和累积（谭友莉等，2014）。多个温度因子（4-8月平均气温、4月均温、7月均温、平均地温等）与景天庚糖和谷甾醇的含量表现出正相关性，对黄酮含量表现出负相关，说明适度高温有利于景天庚糖和谷甾醇的合成，适度低温有利于黄酮类物质的合成。这可能是适度高温利于植株的生长发育，促进糖类和甾醇类成分合成途径中关键酶基因的表达，促使相关酶活性增强；适度低温则促进黄酮类成分合成途径相关酶活性大幅度提高。郭旭琴（2012）研究也表明，低温促进银杏（Ginkgo biloba）叶黄酮类物质生物合成关键酶基因的表达，提高相关酶活性。昼夜温差可以显著影响植物的生长发育、新陈代谢、物质合成、运输以及累积等过程（谢彩香等，2011），较大的温差利于景天三七总黄酮、谷甾醇和景天庚糖的累积，尤其以总黄酮含量增加最为明显。充足的水分供给是保证植物正常生长代谢和次生代谢物质累积的前提条件（李小伟等，2018），降水充足有利于总黄酮和生物碱的累积，降水不足则景天庚糖和谷甾醇代谢合成较多。

植物活性物质的积累与产地的气候、土壤、地形和水质等密切相关，环境气候和土壤元素对植物活性物质的影响已被广泛证实（付三雄等，2014），本研究发现了对景天三七活性成分的代谢影响较大的土壤和气象因子，但这些影响并不是孤立的，而是多种生态因子综合作用的结果。由于地理现象与问题的复杂性，它们之间的关系很难用简单的统计方法来分析，因此对于生态因子对植物活性物质的影响，应加强量化的多因素综合研究，并加强生态因子对植物活性物质形成过程中生理生化代谢途径的影响研究（杨庆珍等，2015）。为了更准确评价景天三七活性成分在不同生态型区域的含量变化，有必要在今后工作中开展不同年际间的研究，以期为景天三七的引种栽培及高效生产提供更精确的参考。

4 结论

本研究通过对 3个引种区景天三七活性成分的相关性分析和冗余分析发现，大荔引种区景天庚糖和谷甾醇的含量显著高于鄠邑和洛南引种区，洛南引种区的总黄酮含量显著高于其他引种区，以总黄酮变异系数最大，受土壤和气候的影响较大。土壤中铜、钙、铁的含量及日温差、平均气温是影响景天三七活性成分含量的主要生态因素。景天庚糖含量与谷甾醇之间呈极显著正相关，二者的累积效应与土壤中钙含量、平均气温呈显著正相关，与速效钾、镁、锰、锌及多个温度因子呈正相关，与降水量呈负相关；生物碱含量对生态因子的响应与谷甾醇和景天庚糖总体相反；景天三七中总黄酮含量与日温差呈显著正相关，与土壤中锰、锌、有效磷、镁、钙、降雨量呈正相关，与多个温度因子呈负相关。

总体而言，关中东部渭南大荔引种区土壤中钙含量高、平均气温较高，降水量相对较少，有利于景天三七活性成分的形成与累积，尤其以景天庚糖和谷甾醇含量增加最为明显，是陕西栽培景天三七较适宜的生态区。