包装饮用水中铜绿假单胞菌检验方法相关问题的探讨

李 静

（山西省食品质量安全监督检验研究院，山西太原 030012）

铜绿假单胞菌原名绿脓杆菌，是一种常见的条件致病菌，分类学上属于细菌界变形菌门γ-变形菌纲、假单胞菌目、假单胞菌科、假单胞菌属，革兰氏阴性杆菌。菌体细长且长短不一，有时呈球杆状或线状，成对或短链状排列。铜绿假单胞菌在自然界分布极为广泛，是土壤中存在的最常见的细菌之一，水、空气、人的皮肤、呼吸道和肠道等都有该菌存在。铜绿假单胞菌为专性需氧菌，生长温度范围25 ℃～42 ℃，该菌在4 ℃不生长而在42 ℃可以生长，易在潮湿的环境下存活，是区别于其他细菌的显著特征之一。铜绿假单胞菌是条件致病菌，即在某种特定条件下才能致病，导致人体肠道疾病、皮肤炎症和继发化脓感染，急性肠道疾病和皮肤炎症，可引发角膜炎、肺炎等下呼吸道、婴儿腹泻泌尿系统感染。铜绿假单胞菌耐药性强，对抵抗力较差的人群危害更大，可引起继发感染或混合感染的慢性炎症，甚至引起诸如脑炎、败血症等严重急性感染。

目前，我国市场上生产销售的包装饮用水（除生活饮用水、饮用天然矿泉水外）应符合《食品安全国家标准 包装饮用水》（GB 19298—2014）。标准中铜绿假单胞菌的限值规定为n=5，c=0，m=0（n 为同一批次产品应采集的样品件数；c 为最大可允许超出m 值的样品数；m 为微生物指标可接受水平限量值）。即一个批次包装饮用水采集样品数量为5 桶，任何一桶水中都不可检出铜绿假单胞菌，否则就判定为铜绿假单胞菌项目不合格。

包装饮用水中铜绿假单胞菌检验采用《食品安全国家标准 饮用天然矿泉水检验方法》（GB 8538—2016）中进行测定，为保证测定结果准确，在实际操作过程中，应根据水样污染情况选择合适的稀释梯度，并注意滤膜放置、菌落纯化、绿脓菌素确认试验等关键环节对试验结果的影响。

1 材料与方法

1.1 样品

样品来源于省内销售的桶装饮用水，共计293批。

1.2 试剂与培养基

假单胞菌琼脂基础培养基/CN 琼脂、金氏B 培养基、乙酰胺液体培养基、绿脓菌素测定用培养基、钠氏试剂、营养琼脂、氧化酶试剂，北京陆桥技术股份有限公司；三氯甲烷、分析纯，天津市化学试剂有限公司；盐酸，分析纯，北京化工厂；甘油，分析纯，天津市天力化学试剂有限公司。

1.3 标准菌株

铜绿假单胞菌标准菌株（ATCC 27853）；荧光假单胞菌标准菌株（CICC 21620）。

1.4 仪器设备

SSM-6 多联过滤器，天津奥特赛恩斯仪器有限公司；0.45 μm 微孔滤膜，上海兴亚净化材料厂；BSC-1300IIA2 生物安全柜，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；BPC-500F 生化培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；EA-160IFE 紫外灯。

2 检验方法

采用GB 8538—2016 中滤膜法测定桶装饮用水中铜绿假单胞菌，在100 级的洁净工作台进行过滤操作，使用孔径0.45 μm 滤膜过滤250 mL 水样或稀释液，将滤膜移至CN 琼脂培养基上，在培养箱中36 ℃培养48 h 后观察CN 平板上菌落形态，并进一步验证可疑菌落。

在CN 琼脂平板上可能生长的菌落形态有：蓝/绿色菌落、产荧光非蓝绿色菌落、红褐色菌落、其他颜色菌落。不同颜色形态菌落要进一步进行验证（见表1）。CN 琼脂平板上不同菌落形态，进行相应试验验证后确定可疑菌落是否为铜绿假单胞菌，确定后计数并得出结论。

表1 铜绿假单胞菌在CN 琼脂平板上菌落形态的选择与判定

3 结果

共计检验桶装饮用水293 批次，其中检出铜绿假单胞菌的有27 批次，检出率为9.22%。检测结果表明桶装饮用水中铜绿假单胞菌的检出率相对较高。

4 讨论

为保证包装饮用水中铜绿假单胞菌不出现漏检和假阴性结果，总结得出在检验过程中需要注意以下几点，以降低漏检和假阴性的可能性。

4.1 过滤水样

考虑到水样受污染程度未知且不一致，可以按照GB 4789.2 中样品稀释的要求，按照原液（必选）、1∶10、1∶100、1∶1000 的递增稀释比例，选择2～3 个连续的稀释度，然后再进行过滤，这样如果水样受污染程度严重，将样品稀释后过滤，保证滤膜上生长的菌落数量在适宜范围内，从而更好地计数和挑取单个菌落做验证试验，计数时按照GB 4789.2 中7.1 的计算方法来进行。

4.2 滤膜的放置

放置滤膜时，应该与培养基表面紧密贴合住，不能产生空隙，因为产生空隙的地方会造成菌落缺乏营养而限制其生长，最终影响铜绿假单胞菌的生长，导致计数不够准确。

4.3 纯化可疑菌落

如果滤膜上生长的菌落过多影响计数，需进行多次分离纯化（可使用CN 平板或营养琼脂平板），直至出现多个单菌落以利于挑取单菌落进行验证试验。

4.4 绿脓菌素试验

饮用天然矿泉水检验方法GB 8538 修订后，微生物检验项目主要变化是铜绿假单胞菌的检验增加了绿脓菌素验证试验。要求CN 琼脂平板上长出蓝/绿色菌落不能直接判定为铜绿假单胞菌阳性（2008 版检验方法无此项要求），而是需要经过绿脓菌素试验验证才能最终判定为阳性。在进行绿脓菌素试验时，必须挑取CN 平板上新鲜的（生长24 h～48 h）不同类型的单菌落各2～3 个进行培养，其次要注意用三氯甲烷浸泡溶解的时间问题，必须待三氯甲烷提取液由无色变为蓝色后，方可将其移至另一试管中滴加1 moL/L 盐酸，振荡后静置，最后判定结果。