驼绒藜和苜蓿对苏尼特羊增重及瘤胃细菌区系的影响

2019-06-18祁云霞王晓娟伊风艳吴江鸿

中国畜牧杂志 2019年6期

杨鼎，祁云霞，王晓娟，伊风艳，吴江鸿,3*

（1.中国科学院内蒙古草业研究中心，内蒙古呼和浩特 010031；2.内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古呼和浩特 010031；3.内蒙古民族大学动物科学技术学院，内蒙古通辽028000）

驼绒藜（Ceratoides Latens，CL）又名优若藜，属多年生半灌木，分布较广，具有适应性强、利用年限长、耐旱、耐寒和耐牧性强等优良特性，驼绒藜种植面积达73.33 km2，每年可提供鲜驼绒藜数百万吨，是一种很可观的饲草资源，利用前景广阔[1]。苜蓿（Alfalfa）是世界上种植面积较大的一种多年生豆科牧草，由于其具有产草量高、营养丰富、适口性好、易于家畜消化等特点，被誉为“牧草之王”[2]。与苜蓿相比，驼绒藜纤维含量高而蛋白含量低，在营养成分和产量上都处于劣势，但驼绒藜适宜在干旱半干旱、水肥条件差的地区大面积生长，这对保护当地生态和降低饲草成本具有重要意义。

瘤胃的消化作用主要依赖于瘤胃内复杂多样的微生物[3]。不同的饮食结构可直接影响肠道中的微生物，而微生物种类的差异可以反向影响宿主的营养吸收[4]。在舍饲条件下，饲料种类都比较单一，可能导致羊只营养不良。通过牧草组合调整瘤胃微生物的菌群结构进而达到或近乎于放牧条件下的菌群结构，可提高舍饲羊的肉品质[5]。虽然不同牧草间存在组合效应，但研究单一牧草对瘤胃微生物菌群结构的影响是解决上述问题的基础。

苏尼特羊是优良的地方蒙古绵羊品种，素以肉质细嫩味道鲜美而闻名。然而舍饲养殖后羊肉品质发生了改变，因此亟待阐明营养物质影响肉品质的分子机制。本研究选取遗传背景相同的苏尼特双胞胎羔羊（降低个体差异，缩小样本量），饲喂驼绒藜和苜蓿2 种颗粒饲料后对羊瘤胃液中细菌的16S rDNA 进行高通量测序，比较饲喂不同饲料的绵羊瘤胃细菌区系的差异性，为在舍饲条件下通过牧草组合调整瘤胃微生物的菌群结构进而达到或近乎于放牧条件下的菌群结构奠定数据和理论基础。

1 材料与方法

1.1 饲料原料及成分华北驼绒藜和紫花苜蓿均收获于2014 年9 月中旬四子王旗，营养成分见表1。试验日粮粗饲料与精饲料比为3∶1，精料为内蒙古正大有限公司的成品羊饲料（冬春宝精补料），粗饲料为华北驼绒藜和苜蓿，把粗饲料粉碎（80 目）与精料按比例混匀，加工成直径8 mm 颗粒化混合日粮，2 种颗粒饲料的营养成分见表2。驼绒藜颗粒料的酸性洗涤纤维、中性洗涤纤维都高于苜蓿颗粒料，粗蛋白质含量低于苜蓿颗粒料。

表1 驼绒藜与苜蓿干草营养成分 %

表2 驼绒藜与苜蓿颗粒饲料的营养成分 %

1.2 试验设计及饲养管理选取4 对（共8 只）3 月龄、（25±3）kg 双胞胎苏尼特母羊分为2 组，分别记为驼绒藜组（A1、B1、C1、D1）、苜蓿组（A2、B2、C2、D2），饲喂试验在内蒙古康辉牧业第六牧场进行。预试期15 d，正试期96 d。

试验羊按不同处理在封闭式栋舍单圈舍饲，每天饲喂3 次（07：00、12：00、19：00），试验期前20 d 每只羊每次精确喂1.8 kg/d 全混颗粒日粮，之后每10 d 每只羊增加饲喂相应颗粒日粮0.3 kg，保证试验期内所有羊均自由采食。免疫、驱虫、药浴及疫病防治等按常规正常进行，自由饮水。每试验组添加羊舔砖1 块（防止微量元素缺乏）。饲喂期间对每只试验羊定期称重，组间增重趋势由Excel 计算每次称重平均值以及标准误差绘制而成。饲喂试验结束后，屠宰所有试验羊，采用4 层纱布过滤法立即将瘤胃固态内容物样品放入液氮保存，并送往北京百迈克生物科技有限公司，进行16S rRNA 基因测序。

1.3 16S rRNA 基因组文库的构建参照OMEGA DNA Kit试剂盒说明，抽提1.2 所取样品细菌基因组DNA，根据细菌V3-V4 区通用引物：338F（5'-ACTCCTACGGGAGGC AGCA-3'）、806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'），合并引物接头，进行PCR 扩增并对其产物进行纯化、定量和均一化形成测序文库，质检合格的文库用Illumina MiSeq PE300 测序。

1.4 统计分析首先对原始测序序列进行质控过滤[6]：根据PE reads 之间的Overlap 关系，将Miseq 测序得到的双端序列数据拼接（Merge）成1 条序列Tags，同时对Reads 的质量和 Merge 的效果进行质控过滤。①PE reads 拼接：使用 FLASH（v1.2.7）软件，按照最小overlap 长度10 bp，overlap 区允许的最大错配比率为0.2，对每个样品的reads 进行拼接，得到的拼接序列即原始Tags 数据（Raw Tags）；②Tags 过滤：使用Trimmomatic（v0.33）软件，对拼接得到的Raw Tags 进行过滤，参数为设置 50 bp 的窗口，如果窗口内的平均质量值低于20，从窗口开始截去后端碱基，过滤质控后长度小于Tags 长度75%的Tags，得到高质量的Tags 数据。双端拼接，得到优化序列Tags[7]，使用UCHIME[8]软件鉴定并去除嵌合体序列，利用QIIME软件[9]中的UCLUST[10]对97% 相似度的Tags 进行聚类并获得OTU，并基于Silva（V132）分类学数据库对OTU 进行微生物分类学注释。

基于OTU 分析结果，对样品在各个分类水平上进行分类学Alpha 多样性及Beta 多样性分析。包括利用Qiime 软件绘制稀释性曲线[11]，应用软件Mothur中的summary.single 命令和metastats 命令，分别计算Chaol、ACE、Shannon、Simpson 参数和两组之间的差异显著性分析。此外，将所有细菌按分类学统计并利用Unifrac 算法通过R 语言工具绘制样品间主坐标分析图（PCoA），以及组间多样性分析。

2 结果

2.1 不同饲料对苏尼特羊增重效果的影响由图1 可见，饲喂苜蓿的羔羊增重达到0.19 kg/d，显著高于驼绒藜组（P＜0.001）。

2.2 不同饲料组的瘤胃细菌群落结构的变化对16S rRNA 基因测序数据进行拼接和质控过滤，8 份样品共产生Tags 868 901 条，平均每个样品产生108 613 条Tags。所有8 只羊瘤胃细菌种类在门分类学水平上共包括12 个门（图2、图3），拟杆菌门和厚壁菌门是受饲料影响最大的2 类细菌。其中，饲喂驼绒藜的拟杆菌门占70.1%、厚壁菌门19.3%；而饲喂苜蓿后拟杆菌门升高到86.5%，厚壁菌门降至9.0%。

图1 不同饲料对苏尼特羊增重效果的影响

图2 饲喂驼绒藜颗粒饲料瘤胃细菌在门分类水平上的比例

图3 饲喂苜蓿颗粒饲料瘤胃细菌在门分类水平上的比例

在属分类学水平上，8 只羊瘤胃细菌种类共包括28 个属的细菌。2 组样品中相对丰度最大的可培养细菌为普雷沃菌和肠道RC9 菌（图4），其中饲喂驼绒藜的普雷沃菌平均丰度为32.6%，显著小于苜蓿的平均丰度60.24%（P=0.028）；而肠道RC9 菌在2 种饲料饲喂下没有显著差异。Shannon 值显示，饲喂驼绒藜可以显著提高瘤胃中细菌的多样性（P＜0.01）（表3）。

对多样品进行Beta 多样性分析，主坐标分析（PCoA）可以发现饲喂驼绒藜的样品点与饲喂苜蓿的样品点被明显分成2 个部分（图5），即2 组处理造成组间样品细菌多样性的差异较大。组间样品线性判别分析效能值（LDA Effect Size，LEfSe）分析[12]显示，对驼绒藜组来说，影响其瘤胃微生物菌群结构的且丰度有显著差异的菌种有11 种，而对苜蓿组影响其细菌组成的且丰度有显著差异种类仅有5 种（图6）。

图4 样品属分类水平上物种分布柱状图

表3 Alpha 多样性指数

图5 饲喂不同饲料的羊瘤胃内容物样品间主坐标分析

图6 不同饲料饲喂下羊瘤胃内容物样品丰度差异细菌分布图

3 讨论

羊瘤胃中细菌种类丰富，其中优势菌群在营养代谢中起主要作用。本研究中，饲喂2 种饲料后瘤胃菌群结构中含量最多的细菌种类依然是厚壁菌门和拟杆菌门。韩旭峰[13]研究发现，拟杆菌门和厚壁菌门是不同精粗比日粮处理组的陕北白绒山羊瘤胃内含量最多的2 种细菌。拟杆菌门在瘤胃代谢中具有重要的作用。Kang 等[14]应用16S rRNA 构建文库研究瘤胃微生物发现，拟杆菌门的细菌占到总RNA 的30%左右。Han 等[15]研究发现，80～100 d 的羔山羊肠道微生物主要为厚壁菌门和互养菌门，但当羔羊长到110 d 时主要肠道微生物为厚壁菌门和拟杆菌门，断奶可改变肠道微生物菌群结构。本研究中，羊瘤胃内优势细菌为厚壁菌门和拟杆菌门，而改变日粮结构可以直接影响菌群含量及比例，这与前人研究结果一致。

瘤胃厚壁菌门和拟杆菌门对饲粮中纤维和蛋白比例有一定的选择性。Kim 等[16]和Petri 等[17]发现，采食高粗料饲粮的肉牛粪便和瘤胃中的拟杆菌门含量比采食高谷物饲粮的肉牛显著降低。由于驼绒藜纤维素较高，使得本研究中饲喂驼绒藜的羊瘤胃内厚壁菌门的丰度有所提高，其中瘤胃球菌、产琥珀酸丝状杆菌的相对丰度也较饲喂苜蓿的羊高，而拟杆菌门的相对丰度有降低趋势，这一结果与Kim 等[16]的结论一致。

厚壁菌门主要分解纤维类物质，拟杆菌门则在非纤维物质的降解中发挥重要作用[18]。瘤胃内纤维素降解菌种类丰富，主要包括厚壁菌门的瘤胃球菌、溶纤维丁酸弧菌和梭菌属以及产琥珀酸丝状杆菌等[3]。其中瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌被认为是主要的纤维分解细菌[19-20]。究其原因主要是瘤胃球菌可以产生大量纤维素酶和半纤维素酶以分解植物纤维[21]。产琥珀酸丝状杆菌能产生大量的多糖酶，但不能降解木聚糖，也是重要的纤维素降解菌[3]。拟杆菌门由于能够合成降解植物多聚糖酶，具有一定降解纤维素的能力[22-23]。大多数的瘤胃细菌都具有降解蛋白的活性，其中研究最多的是嗜淀粉瘤胃杆菌、溶纤维丁酸弧菌和栖瘤胃普雷沃菌，其中目前已知的数量最多的降解菌是栖瘤胃普雷沃菌[3]。普雷沃菌可大量产生降解二肽键酶IV，具有降解寡肽活性，因此在瘤胃蛋白代谢中具有重要作用[24]。本研究中，饲喂蛋白质含量较高的苜蓿时，瘤胃菌群结构中普雷沃菌（属拟杆菌门）具有最高的相对丰度，而其在驼绒藜组则维持在一个很低的水平。拟杆菌门中丰度较高的细菌还包括肠道RC9 菌。有研究表明，提高饲料中蛋白质含量对于肠道RC9 菌有激增的作用[25]。本研究中肠道RC9 菌在2 种饲料饲喂下瘤胃菌群结构中都具有较高的丰度，推测是由2 种饲草都含有较高的粗蛋白质所致。

蛋白质含量高的饮食结构不仅降低了肠道细菌多样性，还对动物的增肥起到了促进作用。Ley 等[26]对1对肥胖和消瘦的双胞胎肠道微生物进行宏基因组研究发现，与消瘦个体相比，肥胖个体的肠道细菌多样性降低且细菌丰度发生变化。De Filippo 等[27]通过研究非洲贫穷地区儿童（以高纤维素食物为主）和欧洲发达国家儿童（以高蛋白食物为主）肠道微生物多样性变化，发现非洲儿童的肠道微生物多样性要远远高于欧洲儿童，而欧洲儿童多易超重；此外，超重人群的肠道微生物多样性也要明显低于正常体重人群。

快速增肥和提高肉品质是畜牧业的两大目标，但二者往往不能兼得。舍饲羊的优点是家畜出栏快，增肥效果明显但肉品质差；放牧羊尽管增肥慢出栏周期长，但牧草种类可以影响肉羊生长率、胴体重，还可以影响肉的风味[28]，以致其味道鲜美得到越来越多消费者的青睐，羊肉价格也比舍饲羊高。舍饲和放牧的主要差别就是饲粮组成，舍饲单一，而放牧多样化。本研究结果表明，增重效果较好的饲喂苜蓿组在瘤胃细菌多样性上却低于饲喂驼绒藜组。由此可以假想，放牧羊与舍饲羊是因采食不同品种饲草导致羊瘤胃微生物多样性的不同，进而改变了营养物质的多样化最终影响羊肉品质。即饲草品种越多样，羊瘤胃微生物越多样，羊肉品质越好。此外，一个较高的羊瘤胃微生物多样性可以营造一个较稳定的瘤胃微生态环境，有利于抵抗外来病原微生物的入侵。生产中可以针对不同生产目的，对日粮结构进行调整。如快速出栏的育肥羊可以适当加大苜蓿的比例快速增肥，而怀孕母羊可以适当增加驼绒藜等高纤维饲草的比例。