小分子有机物对土壤酶活性及微生物多样性的影响

司 鹏，邵 微，于会丽，乔宪生，杨晓静，高登涛，王志强

（1．中国农业科学院郑州果树研究所，河南 郑州 450009；2．河南农业大学林学院，河南 郑州 450002）

小分子有机物（low-molecular-weight substances，LMWOS）包括糖类、氨基酸等，能够加速土壤中碳代谢，并且改变土壤微生物群落［1-6］，这为LMWOS作为新型肥料提供了可能性。然而不同种类的LMWOS对土壤影响的强度与趋向不同［7］，因此研究不同种类的土壤环境之间的关系，进而筛选环境友好型LMWOS变得非常重要。

土壤微生物作为土壤活动的重要参与者，拥有目前自然界最大的生物多样性［8］，能够加速土壤养分循环以及储存植物有效养分，同时能够快速应对环境变化，是土壤环境质量的重要指标［9］。研究方法除了传统的分离鉴定外，还有微平板法（Biolog-Eco板技术）、变性梯度凝胶电泳（DGGE）、脂肪酸甲酯（FAMA）分析法以及磷脂脂肪酸法（PLFA）［10］。Biolog-Eco板技术是以碳源利用为基础，简单快捷地反映微生物代谢群落水平的生理代谢情况［11］，进而评价实际微生物群落底物利用的动力学特征，因方法简便而快速，已经广泛用于评价土壤微生物的功能多样性［12］。土壤酶主要由土壤中的微生物、植物根系以及动植物残体派生而来［13］，反映了土壤中进行的各种生化过程的动向与强度，并且能够表征土壤微生物学活性和土壤肥力的状况［14-16］。本课题研究小分子有机物发现，山梨醇与甘露醇添加物能够改变土壤微生物群落结构，提高土壤酶活性［7］。

甘氨酸属于结构简单的小分子氨基酸，拥有较高的碳氮比，能够作为有机氮源被植物获取，且通常在草地土壤的氨基酸谱中占主导地位［17-18］。而土壤中的甘氨酸既能作为土壤微生物的氮源，也能作为其不稳定的碳底物被利用［19-21］。在比较土壤微生物与植物获取氨基酸的能力时发现，微生物能够吸收更多的氨基酸［21-22］。葡萄糖作为自然界分布最广的重要单糖［23］，是生物的主要供能物质［24］。在农业生产实践中，施入添加葡萄糖的无机肥时，能够明显增加土壤微生物活性，同时促进无机氮素固持，进而减少氮素的流失［25］。甘油能够为微生物生长和代谢过程提供必需的碳源［26］，同时也常常作为肥料成分之一用于农业生产中［27］。但对于甘氨酸、葡萄糖以及甘油对土壤酶活性以及微生物功能多样性的研究尚少。本文选取3种分子量较小的有机物（甘氨酸、葡萄糖及甘油），研究其对土壤微生物及酶活性的激发效应，探讨其作土壤调理剂的可能性，为其进一步的应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验地基本情况

供试土壤于2015年12月采自中国农业科学院郑州果树研究所试验田。区域气候为温带大陆性季风气候。年降水量666 mm，7～8月降水量270 mm，占全年降水的42%。全年平均相对湿度66%。年日照 2 436 h，无霜期 213 d。土壤为砂壤土，pH值7.62，呈微碱性。有机质含量为7.0 g/kg，有效磷含量为 47.15 mg/kg，速效钾为 127.2 mg/kg，铵态氮 10.64 mg/kg，硝态氮 4.17 mg/kg。

1.2 试验设计

以蒸馏水为对照，选取葡萄糖、甘油及甘氨酸3种小分子有机物作为土壤添加物（处理浓度为C 150 mg/kg干土），分别与风干土样（过2 mm筛）混匀，保持含水量为田间持水量的65%，25℃恒温培养。每15 d取样一次，进行土壤酶活性的测定，第 45 d取样分析进行微生物功能多样性分析（用于微生物功能多样性测定的土壤保存在-80℃，用于酶活性测定的土壤保存在-20℃）。每个处理设置3次重复（重复之间相对独立）。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 微生物功能多样性分析方法

取培养45 d的土样进行微生物功能多样性试验。将相当于1 g烘干土（培养45 d的土样）的新鲜土壤加入到盛有99 mL 0.85%灭菌生理盐水的100 mL锥形瓶中，28℃、200 r/min条件下振荡培养20 min，使土样与生理盐水充分混匀，再放置在4℃冰箱内静置30 min，然后加样于Biolog-Eco微孔板中，每孔加入150 μ L。25℃下培养192 h，每24 h用Biolog自动读取仪读数1次。

微生物群落功能多样性的计算［28］：

Biolog-Eco板测定平均吸光值（Average Well Color Development，AWCD），用来表示微生物的整体代谢活性［29］IAWCD=Σ（Ci-R）n-1

丰富度指数S指被利用的碳源的总数，为每孔中（C-R）的值大于0.25的孔个数

土壤微生物碳源利用百分比参照Dickerson［30］的方法计算。

1.3.2 土壤酶活性测定

土壤脲酶活性采用苯酚钠-次氯酸钠比色法测定［31］；土壤碱性磷酸酶活性采用磷酸苯二钠比色法［32］；土壤蔗糖酶活性采用3，5-二硝基水杨酸比色法［33］；土壤过氧化氢酶活性采用KMnO4滴定法［31］。

1.4 数据处理与分析

采用 Excel 2003 和 SPSS 17.0 统计软件进行数据处理与分析，采用Canoco 4.5进行主成分分析（principal component analysis，PCA） 和 冗 余 分 析（redundancy analysis，RDA）； 采 用 Excel 2003 和Sigma Plot 10.0 软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 土壤酶活性变化特征

如图1，添加3种小分子有机物的4种土壤酶活性随着培养时间延长变化趋势基本一致（除添加甘氨酸的土壤过氧化氢酶）。在15～45 d，土壤的过氧化氢酶活性随着培养天数的增加呈先下降后上升的趋势，45～75 d时，葡萄糖与甘油处理土壤过氧化氢酶活性趋于稳定，而甘氨酸处理呈直线上升趋势；葡萄糖与甘油活性始终高于CK。碱性磷酸酶活性在15～30 d时呈上升趋势，在30～ 60 d时呈下降趋势，并在60～ 75 d时保持稳定。土壤蔗糖酶活性在15～30 d上升，在30～60 d时下降，最后在60～75 d时上升。土壤脲酶活性在15～30 d时呈上升趋势，30～45 d随之下降，45～75 d上升（除CK外）。培养45 d时，各处理土壤蔗糖酶变化不明显；而各处理土壤过氧化氢酶活性由高及低为葡萄糖、甘油、CK及甘氨酸，且发现各处理间差异均达到显著水平（经单因素方差分析P＜0.05）；葡萄糖处理的碱性磷酸酶显著低于甘氨酸和甘油（经单因素方差分析P＜0.05）。如图1所示，添加3种小分子有机物能改变土壤4种酶活性，但基本不影响4种酶随时间的变化规律。

图1 不同处理土壤酶活性

选取培养45 d时的土壤进行土壤酶活性主成分分析及微生物群落功能多样性培养。土壤酶活性主成分分析（图2），提取了2个主成分，第一主成分（PCA1）为79.5%，第二主成分（PCA2）为20.5%。 取第一、二个主成分得分作图来表征不同处理土壤4种酶活性，处理间距离的大小表示处理间的相似程度，距离越近相似程度越高。如图2所示，CK样点与甘氨酸样点离散性较大，具有本身分布区域。葡萄糖与甘油样点离散性较小，分布在一个区域，与甘氨酸和CK样点分布区距离较远。3种小分子有机添加物处理的土壤酶活性差异主要表现在PCA1上，即甘氨酸与PCA1呈负相关，而甘油、葡萄糖与PCA1呈正相关。

图2 45 d不同处理的土壤酶活性主成分分析

2.2 土壤微生物群落功能多样性

2.2.1 土壤微生物平均吸光值变化特征

在24 h内，土壤微生物代谢能力缓慢，随后增强（图3）。144 h时，AWCD值变化开始趋于缓慢，至192 h时微生物活性高低依次为：甘油＞对照，葡萄糖＞甘氨酸。在24～192 h内，比较4个处理土壤微生物的AWCD发现：甘油处理的AWCD明显高于其他3个处理；而其他3个处理之间差异不明显。这表明，甘油处理45 d时的土壤微生物活性优于葡萄糖、CK及甘氨酸。

图3 不同处理土壤微生物平均吸光值随培养时间的变化

2.2.2 不同处理的土壤微生物群落功能多样性指数分析

选取土样培养120 h的数据进行土壤微生物代谢的多样性分析。结果发现（表1）：甘油处理土壤的微生物指数U、H′、E以及S指数显著高于葡萄糖、甘氨酸以及CK，D指数显著低于其他处理（P＜0.05）；比较葡萄糖处理与CK土壤微生物多样性指数发现，两者没有显著性差异；甘氨酸处理的U、H′、E以及S指数最低，D指数最高。这表明，甘油处理显著提高了土壤微生物多样性指数。

表1 120 h土壤微生物群落多样性指数

2.2.3 不同处理土壤微生物对Biolog-Eco板6类碳源的利用特征

如图4所示，葡萄糖、甘油以及甘氨酸处理土壤微生物群落对6种碳源的代谢情况明显不同。其中甘油与CK处理土壤微生物群落能够利用6种碳源，而葡萄糖与甘氨酸处理土壤微生物群落对胺类碳源利用百分比AM最低，几乎为零；CK与甘氨酸处理微生物群落利用聚合物百分比PM明显高于葡萄糖和甘油处理；甘油与甘氨酸处理微生物群落利用酚类的百分比PA明显低于葡萄糖与CK。这表明，3种小分子有机添加物能够改变土壤微生物群落结构以及碳源代谢情况。

图4 土壤微生物对碳源利用百分比

2.2.4 不同处理土壤微生物功能多样性的主成分分析

为了研究3种小分子有机添加物对土壤微生物群落碳源利用多样性（图5），选取120 h对各处理土壤样品碳源利用情况进行主成分分析。提取4个主成分，第一主成分（PCA1）为42.6%，第二主成分（PCA2）为20.5%，第三主成分（PCA3）为10.7%，第四主成分（PCA4）为8.4%，其中前两个主成分累积贡献率达到63.1%。 取前两个主成分得分作图来表征不同处理土壤微生物群落功能多样性。如图5所示，葡萄糖、甘氨酸以及甘油分布在不同区域，处理间样点离散程度较大；3种小分子有机添加物处理的微生物群落碳源代谢的差异性主要在PCA1上，即甘氨酸与PCA1呈正相关，甘油、葡萄糖与PCA1呈负相关；其中甘氨酸和CK样点分布在同一区域，与甘油 、葡萄糖离散性较大；葡萄糖样点与甘油样点各自有分布区域，且葡萄糖分布区在甘油样点分布区上部。这表明，甘油、甘氨酸以及葡萄糖处理能够改变土壤微生物群落功能多样性。

图5 不同处理的微生物功能多样性主成分分析

2.3 土壤微生物多样性与酶活性之间的冗余分析

冗余分析结果表明（如图6所示，培养120 h取样数据），3种小分子有机物对微生物群落多样性影响显著（P＜0.05），4轴的累计特征值达100%，其中第1、2排序轴的特征值分别为0.55和0.153；前2个排序轴相关关系为0，表明第1、2排序轴相互垂直，冗余分析排序结构可信。碱性磷酸酶与微生物功能多样性指数S、U、H′以及CH、AM呈显著正相关，相关系数分别为0.588、0.669、0.616、0.687及0.603，与指数D及蔗糖酶活性呈显著负相关，相关指数分别为-0.737及-0.741。过氧化氢酶活性与蔗糖酶活性及微生物的氨基酸类利用强度AA呈显著正相关，相关系数分别为0.749和0.611，与微生物聚合物类利用强度PM呈显著负相关（-0.582）。蔗糖酶活性与微生物聚合物类的利用强度PM呈负相关，相关系数为-0.669。

图6 微生物功能多样性与土壤酶活性及微生物多样性指数的冗余分析

3 讨论

小分子有机物作为叶面肥添加剂已经被广泛应用［34-36］，然而目前不同种类小分子有机物对土壤微生物与酶活性的影响尚不明确。本文以分子量很小的甘氨酸、葡萄糖及甘油为例，研究其对土壤微生物以及酶活性的激发效应，同时研究其对酶活性影响的持续性。研究发现，培养45 d时，葡萄糖、甘油及甘氨酸依然能够影响土壤微生物群落微生物功能多样性，但是影响有所不同。如图3和表1所示，与CK相比，甘油处理土壤微生物AWCD和多样性指数显著提高，而葡萄糖与甘氨酸处理则没有明显变化。微生物功能多样性PCA分析表明，CK与甘氨酸处理土壤微生物群落多样性相似程度较高，与甘油、葡萄糖相区分。与CK相比，葡萄糖、甘油以及甘氨酸处理均能够明显改变土壤微生物群落的碳源利用百分比。这表明，葡萄糖、甘油以及甘氨酸作为土壤微生物群落的碳源，对于微生物群落结构能够选择性筛选。与甘油相比，葡萄糖与甘氨酸作为常见外源添加碳源，能够满足更多种微生物代谢活动，继而对于土壤微生物群落多样性指数影响不大。因此，与葡萄糖、甘氨酸相比，微生物功能多样性对于甘油处理更加敏感。这与Yu等［7］在研究山梨醇与甘露醇时的结果保持一致，即小分子有机物能够改变土壤微生物群落功能多样性以及碳源利用类型。Ai等［37-38］和Bowles等［39］也发现土壤添加有机物能够驱动土壤微生物群落组分以及碳源代谢改变，这与本研究相符。虽然小分子有机物能够影响土壤微生物群落，但它们对于土壤微生物群落的影响方向与力度不同，因此研究多种小分子有机物对土壤微生物功能多样性的影响，寻求适合小分子有机物作为土壤添加剂变得非常必要。

与土壤微生物功能多样性不同，土壤酶活性能够反应土壤内部各种生化过程的动向与强度［14-15］。酶活性的提高也暗示着土壤环境中营养物质的高速转化，即土壤相关代谢速度提高［40］。3种小分子有机物降解的过程涉及多个生化反应，必然会对土壤养分循环的方向与强度造成影响。如图1所示，添加3种小分子有机物的4种土壤酶活性随着时间延长变化趋势基本一致（除添加甘氨酸的土壤过氧化氢酶）。土壤过氧化氢酶能够清除生物体有毒的过氧化氢，表征土壤的氧化过程的强度，跟土壤有机质的合成紧密相关［41-43］。而葡萄糖与甘油处理土壤的过氧化氢酶活性的升高，表明土壤清除过氧化氢能力的增强，以及其内部动力驱动方向与强度的变化。比较图2、5及6的样品点的分布区域发现，培养45 d时，甘氨酸处理和CK样品点的分布区域距离较近，葡萄糖与甘油处理样品点区域距离较近，同时甘氨酸处理和CK样品点分布区与葡萄糖和甘油处理的样品点分布区分别在第一主成分轴正负端。这表明在土壤酶活性与微生物功能多样性方面，甘氨酸处理与CK土壤相似，而葡萄糖与甘油处理较为相似，同时甘氨酸处理和CK与葡萄糖处理和甘油处理之间存在差异。葡萄糖、甘油以及甘氨酸均具有羟基结构，并且可作为大多数微生物的碳源。而甘氨酸具有氨基，能够为土壤微生物提供氮源［17］，这与葡萄糖与甘油不同。这可能就是影响土壤微生物功能多样性与酶活性主成分样品点分布的原因之一。

在外源添加小分子有机物的土壤中，微生物功能多样性与土壤碱性磷酸酶活性息息相关。微生物多样性指数（除D外）与碱性磷酸酶活性呈正相关，这与Yu等［7］研究土壤添加甘露醇的结果相反（与本次试验为同一批次培养且土壤来源一致）。在同一土壤特性条件下，微生物群落与土壤酶活性的关系受土壤添加物的影响显著，因此土壤酶活性只能在一定情况下表征微生物功能多样性。

培养45 d后，与CK相比，葡萄糖、甘油以及甘氨酸处理土壤微生物功能多样性以及碳源利用百分比显著改变。比较3种小分子有机物处理土壤发现：与葡萄糖和甘氨酸相比，甘油处理土壤微生物活性以及多样性指数显著升高。另外，在3种小分子有机物处理土壤中，碱性磷酸酶、蔗糖酶及过氧化氢酶活性与微生物功能多样性息息相关。