基于多元统计分析的产后异食沙土奶牛生化指标的研究

刘国林 ,李向龙 ,陈永宏 ,葛光伟 ,郭延生 ,钟友刚 ,陶金忠

(1.宁夏大学农学院,宁夏银川750021 ;2.中国农业大学动物医学院,北京海淀 100193)

异食癖是一种味觉错乱性疾病,由于动物代谢紊乱和饲养管理不当等引起的舔食、啃咬不应该采食的异物为特征的一种复杂的疾病综合征[1-2],如奶牛的吃沙、吃土。引起奶牛异食癖的原因有营养因素、疾病因素和饲养管理不当等,有研究指出,动物出现的吃沙、吃土、食胎衣等现象与日粮蛋白质不足或氨基酸缺乏有关[3];当饲料中矿物质元素缺乏或比列失调时,会导致畜禽代谢紊乱、味觉异常而引起异食癖[4]。另外也有究认为,奶牛和犊牛的异食癖与饲料中缺乏各种维生素或一些常量或微量元素有关[5]。奶牛发生异食癖时,会严重影响奶牛的泌乳量并且还会伴发一系列代谢病。因此,深入探索奶牛异食癖的发生机制对该病的防治具有重要的科学意义。

主成分分析(PCA)是一种非监督性的模型分析方法,能够真实反应不同组之间的差异和数据的原始状态,并且能够去除不合格指标,提高准确性[6]。正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)是一种有监督性的模型分析方法,能够提供多对多线性回归建模,并且能够滤除与分类信息无关的噪音,提高模型的解析能力和有效性,适用于两组变量的个数多且都存在多重相关性。

本试验采用PCA 和OPLS-DA,对宁夏某奶牛场15 头异食沙土奶牛和16 头健康的奶牛血样生化指标进行多元统计学分析,旨在通过产后采食沙土奶牛的整体变化规律,阐明该病可能的发生机制。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 全自动生化分析仪(BS-180,深圳迈瑞公司),兽用生化试剂包括:钙(Ca)试剂盒、无机磷(P)试剂盒、甘油三酯(TG)试剂盒、白蛋白(ALB)试剂盒、总胆固醇(TC)试剂盒、尿素(UREA)试剂盒、肌酸激酶(CK)试剂盒、总胆红素(Tbil)试剂盒、碱性磷酸酶(ALP)试剂盒、葡萄糖(Glu)试剂盒、总蛋白(TP)试剂盒、肌酐(CREA)试剂盒、丙氨酸氨基转移酶(ALT)试剂盒、天冬氨酸转移酶(AST)试剂盒、r-谷氨酰胺转移酶(r-GT)试剂盒,兽用生化试剂盒均购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司,试验用水为二次过滤蒸馏水(dd 水)。

1.2 试验动物与分组 选择宁夏某奶牛场31 头头胎、体况相近分娩后15 -22 d 的荷斯坦高产奶牛为试验对象,其中15 头奶牛产后异食沙土和16 头健康奶牛。15 头异食沙土奶牛血样(A 组)和16 头健康奶牛血样(B 组),每组每份血样按组别+阿拉伯数字编号,即A 组血样编号为A1～A15,B 组血样编号为B1～B16。31 头奶牛分娩后15 -22 d 尾静脉采集血液10 mL,肝素钠抗凝,迅速3 000 r/min 离心10 min,分离出血浆,置于-80 ℃保存,以备后续分析。

1.3 血液生化指标测定 血样常温下解冻,参照测定试剂盒的使用方法,应用全自动生化分析仪对血浆中Ca、P、TG、TC、UREA、CK、T-bil、ALP、Glu、CREA、ALT、AST、r-GT、ALB、TP 进行检测。

1.4 数据分析 应用软件SIMCA-P14.1(Umetrics,Umea,Sweden)进行模式识别,数据经处理后,进行多维统计分析,包括无监督主成分分析(PCA)分析和正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA),PCA 和OPLS-DA 用来揭示两组血样生化指标轮廓的变化,相应的变量重要性(Variable importance in the projection,VIP)通过OPLS-DA 模型计算出来。接着根据OPLS-DA 模型VIP>1 为筛选标准,对VIP>1 的生化数据导入SPSS 软件进行单因素方差分析(ANOVA),分析结果用P值表示,P<0.05 视为差异显著。

2 结果

2.1 异食沙土牛与健康牛血样生化指标轮廓的模式识别 首先对所获得的数据进行PCA 分析,其结果用得分散点图(Score plot)来表示,见中插彩版图1。得分散点图中每个点代表1 个血样的所有生化指标,从图中可以看出,两组之间有所重叠,但表现出明显的分离趋势。然后采用OPLS-DA 对数据之间的相关关系进行分析。OPLS-DA 模型的质量采用交叉验证法进行检验,并用交叉验证后得到的R2X、R2Y 和Q2(分别代表血样生化数据可解释的变量、分组信息可解释的变量和模型的可预测度)对模型有效性进行评判。两组奶牛血样OPLS-DA得分散点图(Score plot)(见中插彩版图1),其中R2X 为0.714,R2Y 为0.919,说明用血样生化数据能完全反应两组之间的变量差异,而Q2为0.841,高于0.4,说明模型的可预测度较高。结合模型置换检验,可知Q2截距=-0.668(Q2intercept <0),说明构建的OPLS-DA 模型未发生过度拟合。因此,由PCA、OPL-DA 得分散点图和置换检验图结果可以看出,两组奶牛血样生化指标轮廓存在明显差异。

图1 2 组奶牛血样PCA、OPLS-DA 得分散点图和置换检验图

2.2 异食沙土牛与健康牛血样差异生化标志物的筛选 根据OPLS-DA 的VIP 值,10 个生化标志物VIP 大于1,其中2 组奶牛血浆中的ALP(碱性磷酸酶)和T-bil(总胆红素)虽然VIP 大于1 但浓度都处在正常范围内,不加以考虑,其余8 个生化标志物作为候选差异生化标志物。采用SPSS 软件对这8 个差异生化标志物进行单因素方差分析(ANOVA),结果显示,8 个生化标志物在2 组奶牛血样中差异都显著(P<0.05)。这8 个差异生化标志物VIP 值、P值和异食沙土奶牛与健康奶牛对应的血液生化指标(平均数+标准差表示)(见表1),并且8 个生化标志物在异食沙土奶牛组血样中均有不同程度的降低(见图2)。

表1 差异生化标志物VIP 与异食沙土牛和健康牛对应的血液生化指标

图2 异食沙土牛与健康牛血液生化指标的差异比较图

3 讨论

3.1 血浆甘油三酯、胆固醇和葡萄糖的变化 分娩前期,奶牛干物质摄入(DMI)大幅减少(最高可降至30%)[7];产后,由于分娩应激等使DMI 短期内难以恢复,加之泌乳启动,机体能量供不应求,导致围产期奶牛机体普遍处于能量负平衡(NEB)状态[8]。而且分娩后奶牛需要大量能量,机体通过体脂动员来应对这一状态,脂肪动员是围产期奶牛能量负平衡的必然结果[9]。当脂肪动员产生的大量非酯化脂肪酸(NEFA)超过肝脏氧化能力时,最终分解为甘油三酯,泌乳启动后机体需要大量的TG合成乳脂。而胆固醇的合成来源于乙酸,瘤胃丙酸主要进入肝脏异生为葡萄糖,乙酸则主要进入乳腺参与脂肪酸合成,维持乳脂导致TC 的合成减少。张子扬[10]等研究发现,亚临床低血钙组TC、TG 极显著低于健康组(P<0.01),与本试验结果一致。这可能是奶牛为了满足泌乳需要用于合成乳脂以及糖异生使得体内脂类物质下降。说明异食沙土奶牛发生了能量负平衡,为了满足泌乳的需要,消耗了大量脂肪动员产生的甘油三酯合成乳脂。

葡萄糖(Glu)是动物机体代谢活动所必需的营养物质,血液中的葡萄糖主要来源于肠道的吸收、糖原的分解及糖的异生作用,是反映动物能量代谢的重要指标[11]。围产期奶牛对葡萄糖的需要量大大增加,乳汁生成需要大量的乳糖,并且葡萄糖是乳腺代谢的主要能量来源,几乎体内的全部葡萄糖进入乳腺合成乳糖[12]。有研究显示,生产30 kg 奶至少需要2 kg 血糖合成乳糖[13],导致血液中葡萄糖降低。本试验中,异食沙土奶牛血浆Glu 显著低于健康组(P<0.01),说明异食沙土奶牛存在严重的能量负平衡,采食量下降,能量来源不足,血糖大量消耗致使葡萄糖(Glu)浓度下降。眭丹等[14]对舍饲滩羊异食癖的研究发现,发生异食癖的滩羊血清中Glu 降低,与本试验一致。

3.2 血浆钙磷的变化 钙(Ca)在正常成年奶牛体内99%是以羟基磷灰石的形式储存在骨骼中,对于维持动物健康是至关重要的[15]。钙离子参与着机体许多重要活动,如肌肉收缩、神经传导,促进凝血酶原形成等,是牛奶中钙离子的主要来源,是细胞表面向细胞内传递信息的第二信使[16]。磷(P)是组成骨骼的重要矿物质元素,在维持机体的正常机能中起着非常重要的作用[17]。异食沙土奶牛由于能量负平衡、干物质采食量下降,导致奶牛通过日粮摄入的钙和磷的量不足。加之围产期奶牛由于胎儿快速生长和分娩后泌乳,需要大量的钙离子和磷,导致钙和磷大量流失。有研究发现,荷斯坦奶牛每分泌10 L 初乳机体就会流失23 g 钙,相当于血钙储存水平的9 倍[18];分娩后奶牛泌乳启动,由于乳腺的选择性吸收过程,使乳汁比血液中磷增加7倍[19],导致磷大量消耗。本研究中异食沙土组奶牛血钙和血磷都显著低于健康组(P<0.01),血钙和血磷都降低。产后奶牛钙持续缺乏,容易继发乳房炎和胃肠道疾病等[10],引起代谢紊乱严重的还会导致产后瘫痪。当畜禽饲料中钙供应不足时动物容易发生佝偻病和骨软症,而佝偻病和骨软症是异食癖的主要症状之一。韩天龙等[20]研究发现,矿物质钠、钙、磷、铜、铁等不足,钙、磷比列失调,会引起牛发生异食癖;付广建[21]等研究发现,发生异食癖现象的牛的血液中钙、磷、铜、硒等元素都比较低。以上结果都与本试验一致,说明异食沙土奶牛钙磷平衡已经紊乱,从而引起了奶牛异食沙土。

3.3 血浆蛋白的变化 血清总蛋白(TP),可分为白蛋白(ALB)和球蛋白(GLB)两类,在机体中具有重要的生理功能。TP、ALB、GLB 它们都是由肝脏合成的,作为反映肝细胞蛋白合成代谢功能的指标。有研究指出,日粮蛋白质供给低于营养需要,易导致瘤胃消化功能下降和代谢发生紊乱而发生异食癖[22],与本研究一致。有研究显示,能量负平衡会引起肝脏合成代谢出现异常变化,影响肝脏功能,在肝脏受损的情况下,肝脏合成蛋白质的能力降低[23]。也有研究指出,低血钙症会引起奶牛采食量减少,瘤胃和肠蠕动减弱,导致奶牛消化不良和出现皱胃变位[24]。本试验中,异食沙土组奶牛血浆TP、ALB、GLB 浓度显著低于健康奶牛(P<0.01)。说明异食沙土奶牛由于干物质采食量下降和低钙血症导致蛋白质摄入不足,加之能量负平衡引起肝脏受损合成蛋白质的功能降低,从而导致血浆中TP、ALB、GLB 含量减少。进而引起奶牛营养无法满足需要加之味觉发生异常,就引起了奶牛的异食癖。