血必净注射液对SAP大鼠TLR4信号通路介导肠黏膜屏障功能障碍的影响

欧 娅 黄耀星 苏 伟 罗键雄 陈伟明 唐 翔 陈泳华 张婷婷

广州市第一人民医院，华南理工大学附属第二医院(广州 510180)

重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)是临床较常见的危重症，病情凶险危重，并发症较多，死亡率居高不下[1]。胰酶原位激活并自身消化引起的全身性炎症反应综合征(systemic inflammation response sydrome, SIRS)被认为是SAP的主要发病机制，常导致多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction sydrome, MODS)[2]的发生。研究发现，早期应用血必净注射液能减轻SAP大鼠肠黏膜屏障损伤[3]，但其机制尚未完全明确。本文通过观察血必净注射液对SAP大鼠小肠组织TLR4和NF-κB表达以及血清TNF-α、IL- 6、AMS及DAO水平的影响，探讨血必净注射液对SAP大鼠TLR4信号通路介导肠黏膜屏障功能障碍(intestinal mucosal barrier dysfunctional, IMBD)的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

SPF级成年SD大鼠24只(购自广州中医药大学动物实验中心)，体质量230～280 g，按数字随机法分为空白组(n=8)、对照组(n=8)和治疗组(n=8)。所有大鼠均遵循实验动物伦理学要求进行饲养及实验操作。

1.2 制备模型和获取标本

制模前禁食12 h，可自由饮水。大鼠称重后麻醉，腹腔注射质量浓度为100 g/L的戊巴比妥钠(3 mL/kg)。麻醉成功后仰卧并固定四肢，腹部去毛消毒，上腹部正中切口2～3 cm进腹，寻找十二指肠并提取胆总管，以4号钝性针头穿透胆胰管对侧的十二指肠壁，进入胆胰管约5 mm，以无损伤血管夹固定针头。治疗组和对照组经胆胰管逆行注射质量浓度为45 g/L的牛磺胆酸钠溶液(1 mL/kg，购自美国Sigma公司)，保留3min后松开无损伤血管夹并抽出针头，缝合关腹。空白组予等量生理盐水逆行胆胰管注射。治疗组造模3 h后经鼠尾静脉予3 mL/kg剂量注射血必净注射液(天津红日药业有限公司，国药准字Z2000403)。造模后观察24 h，鼠尾静脉采血送检，然后处死动物并留取小肠组织及胰腺组织送病理检查。

1.3 病理检查

留取大鼠胰腺及小肠组织，质量浓度为100 g/L的甲醛缓冲液固定，常规脱水、石蜡包埋、切片、HE染色，由专一病理医师观察切片，按照Schemidt标准[4]进行胰腺组织病理评分，按照Chiuls分级[5]进行小肠组织病理评分。

1.4 TLR4和NF-κB表达的检测

适量小肠组织研磨至匀浆，低速离心后取上清通过Trizol 法分离提取RNA，经逆转录及RT-PCR技术后，采用免疫荧光定量检测TLR4和NF-κB的表达水平，然后gapdh为内参，通过△△CT法，结果以表达倍数 [2^(-k)]表示。TLR4引物序列：F: 5′-GCCGGAAAGTTATTGTGGTGGT-3′，R: 5′-AT GGGTTTTAGGCGCAGAGTTT-3′。NF-κB引物序列：F: 5′-GGTAGTCCTGATCATGAACTCCC-3′，R: 5′-CC TGGTGCAAATC GTACACAGGC-3′。

1.5 血清炎症因子、AMS及DAO的检测

取外周静脉血，经低速离心后取上清，通过酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清TNF-α、IL- 6、AMS及DAO的水平。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 一般情况

空白组大鼠体质量(248.4±5.2)g，对照组大鼠体质量(245.6±8.6)g，治疗组大鼠体质量(242.2±7.8)g，组间体质量比较差异无统计学意义(P>0.05)。空白组大鼠未见明显异常，造模24 h内无死亡；对照组大鼠有呼吸急促、明显腹胀、反应迟钝、无大便排出等表现，造模24 h内死亡2只；治疗组大鼠有腹胀，反应较迟钝，多数排稀烂便，造模24 h内死亡1只。

2.2 胰腺和小肠组织病理改变及评分

造模24 h后，空白组胰腺组织无明显改变，对照组胰腺组织呈明显炎症性改变，治疗组胰腺组织存在炎症性改变，但较对照组稍轻，见图1。

空白组病理检查未见小肠组织有明显改变；对照组病理检查发现小肠黏膜结构破坏明显，绒毛上皮充血水肿，可见局部上皮脱落及溃疡形成，固有层可见毛细血管及淋巴管扩张，多种圆形细胞浸润明显，毛细血管内可见红细胞集聚；治疗组病理检查发现肠黏膜结构破坏，黏膜层充血水肿和固有层细胞浸润较对照组轻。见图2。

A： 空白组 B： 对照组 C： 治疗组图1 各组胰腺组织的病理变化(HE ×50)

A： 空白组 B： 对照组 C： 治疗组图2 各组小肠组织的病理变化(HE ×50)

对照组和治疗组的胰腺和小肠病理评分高于空白组(P<0.05)，治疗组胰腺和小肠评分低于对照组(P<0.05)，见表1。

2.3 小肠组织TLR4和NF-κB表达

对照组和治疗组小肠组织TLR4和NF-κB表达水平高于空白组(P<0.05)，治疗组小肠组织TLR4和NF-κB表达水平低于对照组(P<0.05)，见表2。

2.4 血清炎症因子

对照组和治疗组血清TNF-α、IL- 6、AMS和DAO的水平对照组高于空白组(P<0.05)。治疗组血清TNF-α、IL- 6、AMS和DAO水平较低于对照组(P<0.05)。见表3。

2.5 血清AMS和DAO

对照组和治疗组血清AMS和DAO的水平较对照组高于空白组(P<0.05)。治疗组血清AMS和DAO水平较低于对照组(P<0.05)。见表4。

表1 各组的胰腺和小肠病理评分

*与空白组比较,**与对照组比较

表2 各组的TLR4和NF-κB表达水平

*与空白组比较,**与对照组比较

表3 各组的血清炎症因子水平

*与空白组比较，**与对照组比较

表4 各组的血清AMS和DAO

*与空白组比较，**与对照组比较

3 讨 论

炎症反应在SAP发病过程中起着重要作用。各种诱因导致胰酶原位激活并引起胰腺自身消化，受损的腺泡分泌IL- 6和TNF-α等炎症因子，激活外周血单核细胞，进一步释放炎症因子再次损伤腺泡细胞，形成恶性循环并发展为SIRS，最终导致MODS的发生[6]。SAP可导致有效循环血量明显减少、肠道缺血-再灌注损伤以及炎症因子的大量释放入循环，肠道肌层能动性受损，肠黏膜屏障功能障碍，肠黏膜水肿并通透性增加，肠源性革兰阴性菌及内毒素穿过肠黏膜屏障易位入血，激活中性粒细胞、巨噬细胞、肥大细胞等炎症反应细胞，产生更多的TNF-α、 IL-1、IL- 6等炎症因子，造成“二次打击”[7]。Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)主要介导革兰阴性细菌感染后脂多糖(LPS)的信号转导，其活化后主要通过髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88, MyD88)依赖性信号通路介导活化下游包含NF-κB在内的多个信号通路，引起以TNF-α等为中心的炎症因子激活，从而导致多种炎症因子的瀑链式释放而产生生物学效应[8]。TNF-α是在重症急性胰腺炎早期引起全身性表现的重要因子，也是引起多器官功能衰竭的重要因素之一，而IL- 6主要由单核细胞、巨噬细胞等在TNF-α等诱导下释放的一种细胞因子，它除对血管内皮细胞及炎性细胞具有直接的激活和毒性作用外，更主要的是诱导急性期蛋白的合成，催化和放大炎性反应，造成组织细胞的损害。同时，炎症反应中大量生产TNF-α反过来又可再激活NF-κB信号通路，形成一个具有放大效应的环路，即“瀑布效应”，进一步加剧炎症反应的发展及组织的破坏，导致MDOS的发生[9]。本研究发现，对照组和治疗组小肠组织TLR4和NF-κB表达、血清TNF-α和IL- 6水平显著高于空白组(P<0.05)，提示SAP发病过程中，小肠组织TLR4信号转导通路被激活，并活化其下游的NF-κB信号通路，上调TNF-α等炎症因子的表达。

二胺氧化酶(diamine oxidase, DAO)存在于哺乳动物的黏膜上层和绒毛上层细胞中，大部分位于小肠黏膜，血浆中含量极低。当肠黏膜通透性增加时，DAO就会通过受损的黏膜入血，故监测血中DAO水平可及时反映肠黏膜损伤程度和通透性变化，成为肠黏膜损伤的重要指标[3]，而最新研究证实，血浆DAO含量的高低与肠黏膜的受损程度相关[10]。朱毅东[11]等研究也发现，在SAP患者血浆TNF-α等炎症因子水平显著升高时，血浆DAO水平也伴随着显著升高，提示两者存在相关性。本研究发现，对照组和治疗组血清AMS和DAO水平高于空白组(P<0.05)，血清TNF-α和IL- 6也高于空白组(P<0.05)，提示SAP发病过程中，SIRS导致循环中存在大量的炎症因子，失控性炎症反应损伤包括胰腺和小肠在内的器官组织，导致胰腺损伤和IMBD。

中医认为SAP的实质是“实热内蕴，瘀热互结”，故治疗上应以解毒通瘀为主[12]。血必净注射液是王今达教授以古方血府逐瘀汤为基础炼制出来的静脉制剂，其主要成分包括丹参、红花、当归、赤芍、川芎等，具有清热解毒、扶正祛邪和活血化瘀等奇效。临床研究发现，血必净注射液可有效控制SAP患者病情发展，降低APACHEⅡ评分，调高治愈率[13]，并能降低SAP患者血TNF-α、IL- 6和C反应蛋白水平[14]，在常规治疗基础上联用治疗SAP具明显的优势[15]。本研究也发现，治疗组小肠组织TLR4和NF-κB表达以及血清TNF-α、IL- 6、AMS和DAO水平低于对照组(P<0.05)，提示血必净注射液可能通过下调TLR4及下游信号通路的转导活化，减少以TNF-α等为中心的多种炎症因子的表达，弱化机体炎症反应，降低机体SIRS，从而达到降低肠黏膜屏障损伤的效果，对IMBD具有一定的保护作用。

综上所述，SIRS在SAP发病过程中起着重要作用，IMBD与肠道组织炎症反应密切相关。血必净注射液可降低小肠组织TLR4和NF-κB的表达，下调SAP大鼠血清TNF-α、IL- 6、AMS和DAO水平，减轻小肠组织炎症反应，可能通过干预TLR4及其下游信号通路延缓IMBD的发生，对肠黏膜屏障具有一定的保护作用，但其中具体机制尚未完全明确，有待进一步研究明确其详细机制。