雌、孕激素对Meis1在人子宫内膜细胞中的表达调控

李海霞 夏正明 钱 坤 章汉旺 胡琳莉 夏 薇

1 广州市第一人民医院生殖医学中心(广州 510180) 2 广州医科大学附属第二医院西院区 (广州 510000) 3 华中科技大学同济医学院附属同济医院妇产科生殖医学中心 (武汉430030) 4 郑州大学第一附属医院生殖医学中心 (郑州 450000)

子宫内膜容受性的形成是胚胎成功着床的一个重要的因素。有关子宫内膜容受性的研究一直是国内外广大学者研究的热点，其重要性尤其体现在辅助生殖领域。徐蓓[1]等通过原位杂交和RT-PCR技术在mRNA水平上检测Meis1在人正常月经周期中子宫内膜中的表达，结果发现Meis1在子宫内膜基质细胞和腺上皮细胞均有表达，且在腺上皮细胞的表达强度高于基质细胞；Meis1在增生期表达较弱，分泌期显著增加,其中分泌中期表达最强。Meis1的这一周期性表达，提示其可能受到体内雌、孕激素的规律调控，从而对子宫内膜容受性的形成和胚胎着床起重要作用，但其具体的调控机制尚不明确。本研究采用免疫细胞化学和western blot在蛋白水平上检测受雌/孕激素干预后人子宫内膜细胞中Meis1的表达，初步阐明其调控的规律。

1 材料与方法

1.1 材料

用于子宫内膜基质细胞原代培养的子宫内膜取自因输卵管或盆腔因素在本院行腹腔镜手术的患者，月经周期28～30天,年龄25～35岁,并排除子宫内膜异位症、生殖系统结核、宫腔粘连等疾病，且近3个月内无激素服用史。

1.2 实验方法

1.2.1 子宫内膜基质细胞(ESC)的分离和培养：将所取的子宫内膜组织立即置于预冷的无菌PBS内，送回实验室，在超净工作台操作。组织用PBS洗三次后，用剪刀尽量剪碎，短暂离心后加入0.1% I型胶原酶37 ℃ 消化20～30min，400目筛网过滤，离心后加入含10%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12，按2×104/mL的细胞密度接种于培养瓶和六孔培养板中，置于CO2体积分数为5%，37 ℃的恒温培养箱中进行培养，其中培养板孔内放有已消毒的 20 mm 盖玻片进行细胞爬片，5天后进行免疫细胞化学染色鉴定。每2天换培养液一次。(图1A为原代培养的ESC，1B为免疫细胞化学显示波形蛋白Vim染色为阳性)。

Ishikawa细胞复苏后用含质量浓度为100 g/L的FBS的DMEM/F12培养(图1C为干预前Ishikawa细胞)。

1.2.2 雌、孕激素干预：待ESC和Ishikawa细胞形成致密单层时传代。用PBS洗细胞2次，加0.25%胰蛋白酶消化，显微镜下观察到细胞收缩、变圆并有部分细胞脱落时即加入含血清培养基终止胰酶的消化作用，用吸管吹打壁上的细胞使其脱落、分离，以1:2比例接种于新培养瓶中，分别分为四组： E2组，P4组，E2+P4组及对照组(C组), 每两天换培养液一次。待第三代细胞长至80%融合，观察细胞状态好时用含10%DCC-FBS的无酚红DMEM/F12预处理24 h，实验各组分别加入17-β雌二醇、MPA、17-β雌二醇+ MPA和无水乙醇进行干预，培养液为含质量浓度为20 g/L的DCC-FBS的无酚红DMEM/F12，干预时，17-β雌二醇和MPA终浓度10- 6M，C组给予同浓度的无水乙醇。干预时间48 h。本实验所用细胞均为第三代细胞。

1.2.3 免疫细胞化学(ICC)：将上述各标本用PBS(pH7.2～7.6)清洗3次，冰丙酮固定15min。空气干燥5min。再用PBS清洗标本3次，质量浓度为5 g/L的Triton X-100(PBS配制) 孵育20min。PBS清洗标本3次，3%H2O2孵育15min。PBS清洗标本3次，封闭血清孵育(5%正常二抗血清DPBS液)20min。一抗孵育(PBS配，Meis1单克隆抗体滴度1:100，波形蛋白Vim单克隆抗体滴度1:400，湿盒)4 ℃过夜。阴性对照用PBS液。PBS清洗标本3次，二抗工作液孵育(湿盒)37 ℃, 30min。PBS清洗标本3次。C液(湿盒)37 ℃,30min。PBS清洗标本3次。最后用DAB显色，阳性显色为棕黄色。苏木素复染，自来水洗，封片后镜下观察。

1.2.4 Western blot： 提取细胞总蛋白： 将培养瓶(培养液倒掉)放于预冷0 ℃的平面上，用事先预冷的PBS漂洗细胞2次，吸净培养瓶中残留的PBS。取含有PMSF的三去污裂解液40 μL，加到培养瓶中，置于冰上15～20min。用细胞刮棒刮培养瓶细胞面，用吸管将细胞碎片及裂解液一起转移到1 mL的EP管中。低温离心机(4 ℃)12 000 g，离心5min。取上清提取细胞总蛋白。采用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度后，各组样品(分别取50 μg蛋白，以质量浓度为100 g/L的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)分离蛋白，350 mA进行恒流电转移1 h，将蛋白质转移至硝酸纤维素膜(PVDF膜)上。再根据滤膜面积以0.1 mL/cm2的量加入含质量浓度为50 g/L的脱脂奶粉的TBST(含0.1% Tween-20)封闭，室温1 h。加入用5%脱脂奶粉的TBST稀释的一抗，室温振摇，与膜共同孵育1 h，然后4 ℃过夜(羊抗Meis1 单克隆抗体浓度为1:200，兔抗GAPDH 单克隆抗体浓度为1:500)。洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的相应二抗，与膜共同孵育1 h，室温振摇(兔抗羊多克隆抗体浓度为1:1000、羊抗兔多克隆抗体浓度为1:3000)，充分洗涤后采用ECL法显影曝光。用Bio-Rad图像分析系统对western blot目的条带进行光密度扫描，然后用Quantity One 软件进行分析，以Meis1/β-actin的相对光密度值表示结果。

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 干预前ESC和Ishikawa细胞及ESC鉴定

2.1.1 原代培养的ESC及鉴定结果： ESC在接种后半小时开始贴壁，细胞呈梭形(图1A)。波形蛋白(vitemin,Vim)是ESC的特异性标记。采用免疫细胞化学显示，Vim染色呈阳性，阳性细胞的胞质呈棕色，尤以核周色深，胞核不着色(图1B)。

2.1.2 干预前Ishikawa细胞： Ishikawa细胞呈多角形，贴壁生长，见图1C所示。

图1 显微镜下干预前ESC和Ishikawa细胞形态及ESC鉴定(×100)A： 原代培养的ESC；B： 免疫细胞化学显示波形蛋白(Vim)阳性；C： Ishikawa细胞

2.2 Meis1在ESC中的表达及调控

2.2.1 Meis1在ESC中的定位分析： 通过免疫细胞化学显示，Meis1表达在ESC的细胞核中，见图2B所示。

图2 免疫细胞化学结果显示Meis1定位于ESC细胞核中A为培养的正常ESC，B为免疫细胞化学所示Meis1表达于ESC的细胞核中(SABC，400×)

2.2.2 在ESC中，雌、孕激素调控Meis1的表达： 分别提取E2, P4, E2+P4及C组的细胞蛋白行Western blot。结果显示，E2、P4和 E2+P4三组中Meis1平均蛋白表达水平高于对照组(P<0.05)。Meis1在E2、P4和 E2+P4组之间的表达水平亦有差异(P<0.05)，E2+P4组表达最高。以Meis1/β-actin灰度比值作为Meis1蛋白的相对表达值，其电泳图谱和半定量分析结果见图3：

图3 雌、孕激素对Meis1在ESC中的表达影响E： 雌激素干预组 P： 孕激素干预组 E+P： 雌、孕激素联合干预组 C： 对照组(*P<0.05，与对照相比；△P<0.05，与E组相比；#P<0.05，与E和P组相比)。

2.3 Meis1在Ishikawa细胞中的表达及调控

2.3.1 Meis1在Ishikawa细胞中的定位分析： 通过免疫细胞化学显示，Meis1表达在Ishikawa细胞的细胞核中，见图4B。

图4 免疫细胞化学结果显示Meis1定位于Ishikawa细胞胞核中A为培养的正常Ishikawa细胞，B为免疫细胞化学所示Meis1表达于Ishikawa细胞的细胞核中(SABC，400×)

2.3.2 在Ishikawa细胞中，雌、孕激素调控Meis1的表达： 分别提取E2, P4, E2+P4及C组的细胞蛋白行western blot。E2、P4和 E2+P4均使Meis1表达增高，与对照组比较无差异(P>0.05)，E2、P4和 E2+P4各组间亦无差异(P>0.05)。以Meis1/β-actin灰度比值作为Meis1蛋白的相对表达值，其电泳图谱和半定量分析结果见图5所示：

图5 雌、孕激素对Meis1在Ishikawa细胞中的表达影响E： 雌激素干预组 P： 孕激素干预组 E+P： 雌、孕激素联合干预组 C： 对照组

3 讨 论

近年来，辅助生殖技术得到了日新月异的发展，但是着床率低下一直是阻碍其进一步发展的瓶颈。胚胎着床是一个复杂的生物学过程，成功的着床须具备具有侵入性的胚胎和具有接受性的子宫内膜。1976年法国的Psychoyos首次提出子宫内膜容受性这一概念。子宫内膜容受性，即母体子宫在某一特定的时期对胚胎植入的接受性。这一时期被称为“着床窗口期”，在人类相当于月经周期的D20～24天，具有严格的时空特异性。在这一时期，子宫内膜中一系列信号转导通路的交联作用和着床相关基因的表达，形成分子级联网络，使子宫内膜进入“容受状态”[2]。有关子宫内膜容受性方面的研究一直是当前研究的热点。

研究证实[3]，在整个月经周期中，HOXA10在ESC及腺上皮细胞中的表达受卵巢雌激素和孕激素的规律调控，且在分泌中、晚期，HOXA10的表达明显增强，雌激素和孕激素均能使HOXA10的表达增强，但孕激素的效应更明显，雌、孕激素联合作用时, HOXA10的表达增强的效应叠加。同时有研究也表明[4]，高水平的孕激素可通过结合孕激素受体后增强HOXA10的表达，从而在子宫内膜ESC蜕膜化中发挥重要作用。提示H0XA10直接受雌、孕激素受体的调节。因此，H0XA10可能作为雌、孕激素作用的桥梁，通过对其下游着床相关基因的调控而介导对子宫内膜分化及其功能调节[5]。研究证实[6]，在正常月经周期中，分泌中、晚期的高水平雌、孕激素及HBEGF能促进转录因子HOXA10在Ishikawa细胞中的表达,这与植入窗的开放时间一致,说明HOXA10基因在胚胎植入中起着重要作用。另有研究发现，类泛素化HOXA10在反复着床失败患者分泌中期子宫内膜的异常高表达，而HOXA10基因的类泛素化影响了HOXA10的转录活性以及蛋白的稳定性，这可能是影响胚胎着床的重要因素[7]。从反面进一步说明了HOXA10在生殖中的作用。

Meis1作为HOXA10的辅因子，有关其在子宫内膜中的表达已有一些相关的报道，但具体的调控机制尚不明确。徐蓓[8]等通过宫腔内脂质体转染的方法降低围着床期小鼠子宫内膜中Meis1的表达水平，结果发现，胚胎着床位点及胞饮突明显减少，子宫内膜容受性分子标记物整合素β3表达也降低，可见Meis1在子宫内膜中的表达为胚胎成功着床所必需。本研究旨在通过研究ESC和Ishikawa细胞在体外受雌、孕激素干预后Meis1蛋白的表达水平，验证Meis1受到雌、孕激素的规律调控，从而在子宫内膜容受性的建立过程中发挥关键性的作用。本实验所用Ishikawa细胞是一种高分化的子宫内膜腺癌细胞系，具有雌、孕激素受体，因其具有与子宫内膜腺上皮细胞相似的生物学特性，是普遍用于研究子宫内膜腺上皮细胞的细胞模型[9-10]。通过免疫细胞化学发现，在ESC和Ishikawa细胞中，Meis1定位于细胞核中。分别用雌、孕激素干预后，通过western blot检测各组细胞中Meis1蛋白的表达水平。结果发现，在ESC中，雌激素和孕激素均能使Meis1表达增强，但孕激素增强的效应更明显，雌、孕激素联合作用时使Meis1表达增强的效应叠加，与HOXA10受雌、孕激素调控的模式一致；在Ishikawa细胞中，Meis1的表达在雌、孕激素作用下有增强趋势。由此可见，转录因子Meis1可能与HOXA10结合形成异源二聚体，介导雌、孕激素的调控作用，影响HOXA10-DNA相互作用的亲和力和特异性，从而影响下游靶着床相关基因的表达，继而在构建子宫内膜容受性独特的分子网络中发挥重要作用。