XIAP、TGF-β1和vimentin在乳腺癌中的表达及临床意义

王文廉，万里新，屈中玉，刘越，吴艳林，赵德堡，刘扬帆

南阳市中心医院肿瘤内科，河南 南阳 473009

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，近年来，随着手术治疗、内分泌治疗和靶向治疗等技术的不断发展，虽然乳腺癌患者的病死率有所下降，但其仍是导致患者死亡的重要原因之一，且乳腺癌的发病率呈逐渐上升趋势[1-3]。乳腺癌的发生发展是一个多种基因、多个步骤、多种信号通路相互作用的复杂过程，目前，乳腺癌的发病机制尚未明确。X染色体连锁的凋亡抑制蛋白（X-linked inhib-itor of apoptosis protein，XIAP）是从人胚胎组织脑中克隆出来的一种细胞凋亡抑制蛋白，是近年来新发现的抑制细胞凋亡的最强蛋白因子，与很多肿瘤的发生、发展密切相关[4]。乳腺癌细胞的转移是导致患者术后预后较差、病死率较高的重要原因，而细胞上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是此过程中的重要环节。转化生 长因 子-β1（transforming grow th factor-β1，TGF-β1）是EMT发生的重要诱导因子，波形蛋白（vimentin）的表达上调是EMT发生的标志，因此，TGF-β1与vimentin在乳腺癌的发生、发展过程中起着重要的作用[5-6]，但 XIAP、TGF-β1和 vimentin在乳腺癌发生发展中作用机制的报道较少。本研究主要对XIAP、TGF-β1和vimentin在乳腺癌组织中的表达情况及临床意义进行探讨，旨在为乳腺癌的临床治疗提供理论依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年11月至2017年11月南阳市中心医院收治的行手术切除术的乳腺癌患者的乳腺癌组织标本。乳腺癌患者的纳入标准：经组织病理学检查确诊为乳腺癌；临床资料和随访资料完整。排除标准：既往接受过放疗、化疗和生物细胞免疫治疗；炎性乳腺癌；哺乳期乳腺癌。根据纳入和排除标准，本研究共纳入82例乳腺癌患者，年龄为43～71岁，中位年龄为55.6岁；＜50岁44例，≥50岁38例；肿瘤直径≥5.0 cm者36例，肿瘤直径＜5.0 cm者46例；TNM分期：Ⅰ期18例，Ⅱ期19例，Ⅲ期20例，Ⅳ期25例；肿瘤分化程度：高分化17例，中分化20例，低分化45例；有淋巴结转移45例，无淋巴结转移37例。另外选取82例乳腺癌患者的癌旁正常组织（距离肿瘤组织5 cm以上）标本作为对照。

1.2 主要试剂与仪器

兔抗人XIAP、TGF-β1和vimentin多克隆抗体均购于美国Abcam公司，二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色试剂盒、免疫组织化学试剂盒均购于武汉博士德生物技术有限公司，RM I128切片机购于德国莱卡公司，BH-2显微镜购于日本OLYMPUS公司。

1.3 免疫组织化学染色方法

术后采用免疫组织化学染色方法检测XIAP、TGF-β1和vimentin蛋白在乳腺癌组织和癌旁正常组织中的表达。石蜡标本均经二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡，梯度乙醇脱水，蜡块切片后于3%双氧水灭活，后在枸橼酸钠缓冲液中于微波炉加热进行抗原修复，然后根据免疫组织化学染色试剂盒采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接（streptavidin-perosidase，SP）法对石蜡标本进行一抗（兔抗人XIAP、TGF-β1和vimentin多克隆抗体）、二抗室温孵育1～2 h，并染色，最后在光镜下观察XIAP、TGF-β1和vimentin蛋白的染色情况。选取磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）代替一抗作为阴性对照。

1.4 免疫组织化学染色结果评分标准及观察指标

免疫组织化学结果判定：XIAP、TGF-β1、vimentin蛋白的阳性着色表达于细胞质，均呈现棕黄色或棕褐色颗粒状。每张切片选取5个高倍视野对染色细胞进行观察并计数，采用半定量法判定阳性结果。根据细胞的着色程度进行评分：未染色计0分，浅黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分。根据阳性细胞数目所占百分比进行评分：无阳性细胞计0分，阳性细胞数目所占百分比为1～24%计1分，阳性细胞数目所占百分比为25%～49%计2分，阳性细胞数目所占百分比为50%～74%计3分，阳性细胞数目所占百分比为75%～100%计4分。两种积分相乘，0～2分为阴性（-），3～4分为弱阳性（+），5～8分为中等阳性（++），9～12分为强阳性（+++）。总分≥3分表示细胞阳性表达，总分＜3分表示细胞阴性表达。观察XIAP、TGF-β1和vimentin在乳腺癌组织和癌旁正常组织中的表达情况，并分析乳腺癌组织中XIAP、TGF-β1和vimentin表达与乳腺癌患者临床特征的关系以及乳腺癌组织中XIAP、TGF-β1和vimentin表达的相关性。

1.5 统计学分析

采用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析。计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验；相关性分析采用Pearson相关性分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同组织中XIAP、TGF-β1和vimentin表达情况的比较

XIAP、TGF-β1、vimentin在乳腺癌组织中的阳性表达率均明显高于癌旁正常组织，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（表1）

表1 不同组织中XIAP、TGF-β1和vimentin表达情况的比较[n（%）]

2.2 不同临床特征乳腺癌患者乳腺癌组织中XIAP、TGF-β1和vimentin阳性表达情况的比较

TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期乳腺癌患者乳腺癌组织中XIAP、TGF-β1及vimentin阳性表达率均高于TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期的乳腺癌患者，差异均有统计学意义（χ2=7.043、5.961、10.478，P＜0.05）；有淋巴结转移乳腺癌患者乳腺癌组织中XIAP、TGF-β1及vimentin阳性表达率均高于无淋巴结转移的乳腺癌患者，差异均有统计学意义（χ2=7.043、5.961、14.417，P＜0.05）。不同年龄、肿瘤直径、肿瘤分化程度乳腺癌患者乳腺癌组织中XIAP、TGF-β1和vimentin的阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表2）

表2 82例不同临床特征乳腺癌患者乳腺癌组织中XIAP、TGF-β1和vimentin的阳性表达情况

2.3 乳腺癌组织中XIAP、TGF-β1和vimentin表达的相关性

经Pearson相关性分析，乳腺癌组织中XIAP与TGF-β1的表达呈正相关（r=0.543，P＜0.01），XIAP与vimentin的表达呈正相关（r=0.584，P＜0.01），TGF-β1与vimentin的表达呈正相关（r=0.657，P＜0.01）。

3 讨论

Crook最早于杆状病毒中发现了凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）家族，并发现IAP能够明显抑制由病毒感染引起的细胞凋亡。XIAP是1996年Peter通过聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）和Southern技术从人胚胎脑组织中克隆出来的一种IAP，是IAP家族中最强的凋亡抑制蛋白和最有效的caspase家族抑制剂。XIAP能够通过直接与caspase 9起始因子和caspase 3、caspase 9效应因子结合，进而抑制caspase家族引起的细胞凋亡。XIAP在机体中除了在外周血淋巴细胞以外的组织中均有表达，其在胃癌、结肠癌、卵巢癌、肺癌等多种肿瘤组织中呈阳性表达，因此，关于XIAP在肿瘤组织中的抗凋亡机制的研究越来越深入，并成为肿瘤基因治疗的研究热点[4,7]。本研究结果显示，XIAP在乳腺癌组织中的阳性表达率明显高于癌旁正常组织（P＜0.01）。另外，TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移乳腺癌患者乳腺癌组织中XIAP的阳性表达率均高于TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移的乳腺癌患者（P＜0.05），说明XIAP在乳腺癌的发生及淋巴结转移的过程中具有重要的作用。

具有极性的、排列整齐的上皮细胞丧失了黏附性而转化形成能够移动的、不稳定的间质细胞的过程称为EMT。在EMT的过程中，间质细胞标志物vimentin的表达水平升高，上皮细胞标志物E-cadherin的表达水平降低[8]。vimentin是一种能够下调细胞表面黏附因子表达的肿瘤蛋白，能够为肿瘤细胞发生远处转移提供有利的条件。vimentin在多种肿瘤组织中呈高表达，特别是在有转移灶的肿瘤组织中的表达水平最高[6,9]。另外，TGF-β1等细胞因子能够诱导EMT的发生。TGF-β1属于TGF-β超家族，此家族包括TGF-β、骨形态蛋白和激活素等。哺乳动物中含有3个TGF-β亚基，分别为TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3。TGF-β1在上游细胞因子的刺激下，能够特异性地识别其下游信使分子Smad2/3，并使Smad2/3磷酸化与Smad4形成寡聚体，并转入细胞核内，与目的基因启动子结合，促使靶基因转录。研究显示，TGF-β1在众多肿瘤组织中呈高表达，并与肿瘤的发生、发展密切相关[5,10-11]。本研究结果显示，TGF-β1、vimentin在乳腺癌组织中的阳性表达率均明显高于癌旁正常组织，同时TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移乳腺癌患者乳腺癌组织中TGF-β1、vimentin的阳性表达率均高于TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移的乳腺癌患者（P＜0.05），而不同年龄、肿瘤直径、肿瘤分化程度乳腺癌患者乳腺癌组织中TGF-β1和vimentin的阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），说明TGF-β1、vimentin在乳腺癌的发生发展及淋巴结转移过程中起重要作用。另外，本研究通过相关性分析还证实了乳腺癌组织中XIAP、TGF-β1、vimentin的表达两两呈正相关，表明三者在乳腺癌的发生、发展过程中起着协同作用。有研究表明，敲除TGF-β1能明显下调HepG2肝癌细胞中PCNA、XIAP、survivin等蛋白的表达，进而抑制肿瘤细胞的生长[12]。亦有研究发现，TGF-β1能够促进肿瘤细胞EMT的形成[13-15]。因此，TGF-β1可以成为乳腺癌基因治疗的靶点。

综上所述，XIAP、TGF-β1、vimentin在乳腺癌组织中的表达水平较高，并与乳腺癌患者的TNM分期、淋巴结转移可能有关，而与乳腺癌患者的年龄、肿瘤直径、肿瘤分化程度可能无关，同时三者的表达两两呈正相关，可作为判断乳腺癌发生和淋巴结转移的参考指标。