TCT阴性CINⅢ级患者的HPV感染状况及感染亚型特点分析△

刘禄，杨娜，刘智

遂宁市中心医院1病理科，2检验科，四川 遂宁 629000

宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）是一组与宫颈浸润癌密切相关的特异性癌前病变，常提示正常宫颈上皮组织发展为宫颈浸润癌的过程。从宫颈癌前病变发展为宫颈癌需要约10年时间，而85%的CINⅢ级病变最终发展为宫颈浸润癌[1]。如能早期发现癌前病变，并在癌前病变阶段就进行医学干预，可明显提高宫颈癌的治愈率。目前，宫颈薄层液基细胞学检测（thinprep liquid-based cytology test，TCT）是筛查CIN及宫颈癌的主要方法之一，但TCT方法存在诸多缺陷，如受主观因素的影响较大、灵敏度较低等。相关研究发现子宫颈TCT结果为阴性，而组织活检结果为CIN，导致临床细胞学诊断结果为假阴性[2-3]。因此，提高CIN的检出率显得尤为重要。人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染是宫颈癌和CIN发生的重要危险因素[4]，持续感染高危型HPV与宫颈癌的发病密切相关。目前已经发现近130种HPV亚型，其中，单一感染HPV高危亚型主要为HPV16、18、26、31、33、35、39、45、52、56、58、59、66、68、82，这15种HPV高危亚型主要引起CINⅡ～Ⅲ级病变以及宫颈癌的发生[5]。中国不同区域的宫颈高度病变及宫颈癌多以感染高危型HPV16和HPV18为主[6]。本研究探索TCT阴性的CINⅢ级病变患者的HPV感染情况和感染亚型特点，以辅助宫颈癌前病变的筛查，降低假阳性率，同时为HPV疫苗接种提供一定的参考依据，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2015年7月至2016年6月于遂宁市中心医院诊治的100例TCT检测结果为阴性且经阴道镜活检判定为CINⅢ级的患者为研究组。TCT检测时，使用特定的宫颈刷，按照相关操作规程在宫颈管和宫颈口旋转数圈，将收集的宫颈脱落细胞送往病理科进行检测。阴道镜活检在电子阴道镜引导下，多点采样。纳入标准：①无宫颈侧切或宫颈全切病史；②距离研究开始的1个月内未进行宫颈病变相关的药物治疗；③采样及活检前3天未使用阴道内药物；④均有性生活史，且采样前3天未发生过性行为。排除标准：①妊娠期或者哺乳期妇女；②存在急性生殖道炎症；③近期内使用过性激素；④依从性差，不配合本研究。研究组患者的年龄为25～60岁，平均年龄为（38.89±4.31）岁；汉族75例，其他民族25例；有服药史92例，无服药史8例。同期另选取100例子宫颈浸润性鳞状细胞癌（squemous cell carcinoma，SCC）患者为对照组。对照组患者的年龄为23～62岁，平均年龄为（39.15±3.90）岁；汉族80例，其他民族20例；有服药史87例，无服药史13例。两组患者的年龄、民族和服药史比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。所有患者均对本研究知情同意并签署知情同意书，且本研究经过本院医学伦理委员会审核通过（L/SCSN-L023）。收集两组患者的石蜡包埋病灶组织。

1.2 仪器与试剂

Bioer Life-Express PCR扩增仪由博日科技有限公司提供，生物恒温杂交仪、DNA提取试剂和HPV基因分型检测试剂均由深圳亚能生物有限公司提供。

1.3 HPV-DNA提取

无菌棉拭子插入被检查者宫颈口，匀速用力旋转5周后取出，置于试管中。HPV DNA采用单管多重聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）-反向点杂交（reverse dot blot，RDB）技术检测。单管PCR反应管中含有21种特异性引物，可以同时扩增21种HPV基因型的目的片段，再将扩增产物与固定在膜条上的分型探针进行杂交，依据杂交信号的有无来判断有无HPV DNA的存在。

1.4 HPV分型检测

1.4.1 片段扩增 将无核水、PCR M ix、Taq酶、特异性引物与DNA样本充分混匀，制备成25μl的反应体系。PCR反应条件：预变性95℃5 s；变性95℃ 20 s，退火55℃ 30 s，延伸72℃ 20 s，共进行40个循环。严格按照标准操作规程（standard operation procedure，SOP）进行操作。

1.4.2 导流杂交 将PCR产物加热变性，之后冰上冷却10 min。将含有特定核酸探针的薄膜固定在生物恒温杂交仪上，生物恒温杂交仪温度控制温度为45℃，将冷却后的PCR产物置于薄膜上，使其流入膜内进行杂交反应，同时除去未结合的DNA。

1.4.3 结果判读 将导流杂交的PCR产物加封闭液孵育5 min，重复2次并用封阻膜进行封阻。除去封闭液，加入酶标液后于25℃孵育3～4 min。采用缓冲液清洗掉多余的酶标液，加入底物显色5 min，并于1 h内判读显色结果，紫色实心点即为HPV对应亚型阳性。

1.5 统计学分析

采用SPSS 19.0软件对数-据进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HPV感染情况的比较

研究组中29例患者发生HPV感染，对照组中78例患者发生HPV感染。研究组患者HPV的总感染率为29.0%（29/100），明显低于对照组患者的78.0%（78/100），差异有统计学意义（χ2=48.256，P＜0.01）。两组HPV阳性患者中均是单一感染所占比例最高，二重感染所占比例次之，三重感染所占比例和四重感染所占比例最低。研究组与对照组HPV阳性患者的上述各感染所占比例比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表1）

表1 两组HPV阳性患者HPV感染情况的比较[n（%）]

2.2 两组HPV阳性患者基线特征的比较

两组HPV阳性患者的年龄、民族、性生活史、婚姻状况、职业比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表2）

表2 两组HPV阳性患者基线特征的比较

2.3 HPV高危亚型感染情况的比较

研究组与对照组HPV阳性患者中HPV16、HPV58、HPV52、HPV33和HPV18高危亚型的感染情况比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表3）

表3 两组HPV阳性患者HPV高危亚型的感染情况

3 讨论

随着病毒的变异和女性社交观念的改变，宫颈癌是中国女性妇科肿瘤中的高发疾病。由于宫颈癌的早期筛查在临床上应用广泛，因此，近年来宫颈癌的发病率和病死率有所下降。CIN是宫颈癌的特异性癌前病变，能够预示宫颈癌的发生，同时尽早地对CIN进行干预能够逆转宫颈癌的发生[7]。因此，早期诊断对于预防宫颈癌的发生，降低宫颈癌的发病率和病死率具有重要意义。TCT检测是目前临床上应用最广泛的宫颈癌筛查方式，能够通过镜检发现癌前病变细胞，区分炎症与感染[8-9]。但有文献报道，TCT检测对于CINⅢ级病变的检出率不高，具有较高的假阳性率，可达49.60%[10]。因此，仅依靠TCT检测难以达到早期筛查宫颈癌的作用。高危型HPV持续感染是宫颈癌发病的最主要的独立危险因素。国内外多篇文献报道TCT检测联合HPV亚型检测能够提高宫颈癌的早期诊断率[11-13]。因此，本研究探讨了TCT阴性的CINⅢ级患者HPV感染情况及感染亚型特点。

Xu等[6]分析了30 165例中国女性HPV阳性的宫颈癌标本，发现高危型HPV16感染是导致中国宫颈癌发生的最优势型别，HPV18、HPV52、HPV58在中国西部地区的感染率相对较高。本研究探究了TCT检测结果为阴性的CINⅢ级患者感染HPV病毒亚型的特点，结果发现，TCT阴性的CINⅢ级患者HPV的感染率为29.0%，其中，TCT阴性的CINⅢ级患者的HPV感染亚型以高危型HPV16为主，提示TCT阴性CINⅢ级漏检HPV16的可能性更大。同时，HPV16的基因多态性较高，E7的高度突变对瘤变细胞的内在生物代谢具有重要的影响，进而在CINⅢ级和宫颈癌的发生中发挥着重要的作用[14]，而这些改变在细胞形态学方面的差异难以被发现。其他高危型HPV依次为HPV58、HPV52、HPV33、HPV18，这与Xu等[6]的研究结果相符。HPV18在中国西南部地区的感染率仅次于HPV16，但本研究中TCT阴性的CINⅢ级患者HPV18的感染比例较低，提示TCT阴性CINⅢ级患者不易漏检HPV18。因此，HPV16基因的高突变可能是引起TCT阴性的原因。进一步提示TCT阴性患者仍有存在HPV感染的风险，因此，应联合使用TCT与HPV亚型检测，以进一步降低CINⅢ级患者的漏检率。

近年来，许多HPV病毒多态性新位点被发现[14-16]。病毒多态性的产生原因可能是由于机体自身免疫系统对病毒的自然选择，也可能是来源于多重感染过程中病毒的相互竞争。本研究发现TCT阴性的CINⅢ级患者的HPV感染以单一亚型感染为主，而HPV16亚型感染是单一亚型感染的主体，这与以往关于CINⅢ级患者HPV感染情况的报道结果类似[17]。在TCT阴性的CINⅢ级患者的HPV多重感染中，主要以二重感染为主，其中，HPV16联合其他亚型感染是二重感染的主要特点。上述结果提示HPV16可能通过某种途径诱发CIN形成，但TCT出现假阴性。

综上所述，TCT阴性的CINⅢ级患者的HPV感染以单一亚型感染为主，HPV16单一感染或联合其他亚型的多重感染是TCT阴性的CINⅢ级患者的主要特点，并推测HPV16可能因其具有病毒多态性而诱发CINⅢ级及宫颈癌的发生，造成了TCT检测的漏诊。尽管本研究发现了CINⅢ级患者的主要HPV感染亚型，但仍有不足之处，如本研究未明确不同HPV分型对CINⅢ级发生和发展的诱导机制，仍需进一步分析与探讨，才能有效地预防、诊断及治疗CINⅢ级，可将其作为下一步的研究方向。本研究提示临床上应更加关注TCT检测联合HPV亚型检测对CINⅢ级及宫颈癌的早期诊断，尤其应该注重HPV16亚型感染的早期预防和早期诊断。