ALK5抑制剂对转化生长因子-β1(TGF-β1)致视网膜色素上皮细胞纤维化的干预作用△

李晓文 宋立果 李冠晓 庞东渤

增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreo-retinopathy，PVR)是一种非血管性致盲性疾病，也是孔源性视网膜脱离和严重眼外伤的常见并发症[1-2]。视网膜发生脱离或裂孔时，富含细胞因子的玻璃体液通过裂孔进入视网膜下间隙，与视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial，RPE)细胞和神经胶质细胞接触，并通过其内所含的细胞因子激活RPE细胞和神经胶质细胞，促进其增殖、迁移，这些细胞在新的环境中受到某些因子如转化生长因子-β1(transforming growth factor-beta1，TGF-β1)的作用发生细胞去极化和表型变化[3-4]，在脱离的视网膜或玻璃体表面形成了纤维增殖膜[5]。增殖膜的主要成分为RPE细胞和神经胶质细胞[6]，因此TGF-β1在RPE细胞的增殖调控中发挥了重要作用[7]。活化素受体样激酶5(activin receptor-like kinase 5，ALK5)是TGF-β1的跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶受体，活化的TGF-β1使ALK5磷酸化而激活，磷酸化的ALK5使其下游的信号分子受体活化，启动细胞内级联反应，从而促进α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)和纤维粘连素(fibronectin，FN)等的表达[8]。SB-431542是特异性Ⅰ型TGF-β1受体抑制剂，能够竞争性结合ALK5激酶功能区ATP占据的位点来发挥抑制作用[9]。国内外已有关于ALK5在成纤维细胞(如肺、肾脏、血管内皮等)内表达的相关报道，但在视网膜方面研究相对较少[10-11]。本实验通过研究TGF-β1对RPE细胞向成纤维细胞转化的影响及SB-431542对其的干预作用，探讨是否可以通过抑制ALK5来阻断TGF-β1的表达，从而抑制RPE细胞的异常增殖和迁移，为临床有效治疗PVR、减少PVR并发症提供一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 细胞来源 一代人RPE细胞：ARPE-19细胞株(美国ADCC细胞库，CRL-2302)。

1.2 主要试剂及仪器 1640培养基(美国HyClone公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；兔抗人ALK5单克隆抗体(德国Acris GmbH抗体公司)；兔抗人α-SMA多克隆抗体、兔抗人Ⅰ型胶原(collagen type Ⅰ,ColⅠ)多克隆抗体、兔抗人FN多克隆抗体(沈阳万类生物有限公司)；兔抗人血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)多克隆抗体(北京鼎国昌盛生物技术有限公司)；免疫荧光试剂盒(碧云天生物技术公司)。

荧光显微镜(日本Nikon公司)；全自动多功能型酶标仪(美国Thermo公司)；高速恒温冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；凝胶成像分析仪(美国Bio-Rad公司)。

1.3 RPE细胞的传代和分组 RPE细胞在含体积分数5%CO2、37 ℃培养箱中进行培养，培养液为含体积分数15%胎牛血清、10 g·L-1青-链霉素双抗的1640完全培养液。待细胞状态良好、生长至融合状态后时，以含2.5 g·L-1胰蛋白酶及0.3 g·L-1EDTA的复合消化液消化，按2.5×106个·cm-2的密度接种于25 cm2培养瓶内进行培养。本实验使用第6～8代ARPE-19细胞，参考文献[12]将细胞分为对照组、TGF-β1处理组、TGF-β1+SB-431542处理组、SB-431542处理组。对照组不做任何处理，其余三组分别用10 μg·L-1TGF-β1、10 μg·L-1TGF-β1+30 μmol·L-1SB-431542、30 μmol·L-1SB-431542处理RPE细胞24 h。

1.4 MTT法检测不同浓度TGF-β1及SB-431542对RPE细胞增殖的影响 收集状态良好的RPE细胞，接种于96孔培养板中，置于含体积分数5%CO2、37 ℃培养箱培养过夜。待细胞生长至70%～80%融合状态后，分别加入含0 μg·L-1、0.1 μg·L-1、1.0 μg·L-1、10.0 μg·L-1的TGF-β1培养基孵育24 h(弃去旧培养基)，再加入含5 g·L-1MTT、不含血清的1640培养基孵育4 h，弃尽培养基，每孔加150 μL DMSO，室温下避光低速振荡10 min，于492 nm处测各孔吸光度(A)值，每孔设5个复孔，计算RPE细胞生存率。同上培养条件下，先加入10.0 μg·L-1TGF-β1作用1 h，再加入含0 μmol·L-1、10 μmol·L-1、20 μmol·L-1、30 μmol·L-1的SB-431542培养基孵育24 h，再次进行上述处理，计算RPE细胞生存率。细胞生存率(%)=[1+(A实验组-A对照组)/A对照组]×100%。

1.5 荧光显微镜下观察RPE细胞形态、免疫荧光法检测各组细胞内ALK5蛋白的表达及分布 6孔板内置无菌细胞爬片，调整细胞密度为每孔 100×103个，待细胞贴壁生长12 h后使用无血清培养基培养6 h，再按照不同组的处理条件处理RPE细胞24 h。倒置相差显微镜下观察各组RPE细胞形态。40 g·L-1多聚甲醛4 ℃固定RPE细胞过夜，加入兔抗人ALK5抗体(1:100稀释)，置于湿盒内4 ℃孵育过夜，FITC标记的山羊抗兔二抗(1:100)室温下孵育1 h，DAPI染核5 min，封片并置于荧光显微镜下观察ALK5蛋白表达及分布。

1.6 细胞划痕实验观察各组细胞迁移情况 将状态良好的RPE细胞均匀接种于6孔板中，置于含体积分数5%CO2、37 ℃培养箱培养。待细胞生长至融合状态后，用移液枪中枪头在6孔板底部顺直径划痕，PBS洗涤3遍去除划下的细胞，更换含体积分数1%胎牛血清的1640培养基，按照不同组的处理条件处理细胞，置于恒温空气培养箱常规培养。分别于划痕后0 h、12 h、24 h在倒置显微镜下观察并拍照。

1.7 Western blot 检测ALK5、VEGF、α-SMA、Col Ⅰ、FN蛋白的表达 使用25 cm2培养瓶培养细胞，待细胞生长融合至70%～80%时，弃去原培养基，按照不同组的处理条件处理细胞24 h；使用RIPA裂解液提取各组RPE细胞总蛋白，BAC蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，100 g·L-1SDS-PAGE胶分离蛋白，半干电转膜，封闭液封闭，添加相应一抗4 ℃孵育过夜，洗膜，加入相应二抗室温下孵育1 h，显影、曝光。使用Image Lab导出所得条带，Image J测定条带的灰度值，计算各组灰度值与同条件下内参灰度值之比作为各种蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 不同浓度TGF-β1和SB-431542对细胞生存率的影响 MTT法检测结果表明，加入0.1 μg·L-1、1.0 μg·L-1、10.0 μg·L-1的TGF-β1后，RPE细胞生存率分别为对照组的(1.06±0.03)倍、(1.17±0.05)倍、(1.33±0.08)倍，细胞生存率的总体比较差异有统计学意义(F=35.90，P<0.05)。先加入10.0 μg·L-1TGF-β1处理1 h后，再加入10 μmol·L-1、20 μmol·L-1、30 μmol·L-1的SB-431542作用24 h，RPE细胞生存率分别为10.0 μg·L-1TGF-β1处理组的(86.69±6.17)%、(78.43±3.14)%、(67.77±6.78)%，细胞生存率的总体比较差异有统计学意义(F=39.42，P<0.05)。TGF-β1可促进RPE细胞增殖，而SB-431542可抑制该增殖作用，二者作用于RPE细胞时均呈剂量依赖性。因此，选用10 μg·L-1TGF-β1及30 μmol·L-1的SB-431542进行后续实验。

2.2 荧光显微镜下各组细胞的形态 对照组RPE细胞呈多角形，大小一致、排列整齐、生长比较规则。TGF-β1处理组RPE细胞与对照组相比，形态发生明显改变，细胞胞体拉长呈长梭形，出现成纤维细胞样外观，生长状态更具侵袭性，且部分细胞之间失去接触性。TGF-β1+SB-431542处理组则部分逆转了RPE细胞的成纤维细胞样改变。SB-431542处理组与对照组相比，细胞形态无明显改变。见图1。

2.3 各组细胞内ALK5蛋白的表达及分布 荧光显微镜下可见，ALK5蛋白在RPE细胞胞浆表达，对照组细胞胞浆呈现弱荧光；TGF-β1处理组细胞胞浆显示强荧光，细胞体呈成纤维细胞样外观；TGF-β1+SB-431542处理组细胞荧光信号较TGF-β1处理组明显减弱，但仍较对照组强；SB-431542处理组与对照组相比则无明显差异。见图2。

2.4 各组RPE细胞迁移情况 划痕实验结果显示，与对照组相比，TGF-β1处理组RPE细胞迁移明显增多，SB-431542处理组无明显变化，而TGF-β1+SB-431542处理组比TGF-β1处理组RPE细胞迁移程度小，说明SB-431542可抑制TGF-β1诱导的RPE细胞的迁移(图3)。

图1 荧光显微镜下各组RPE细胞形态(×200)。A：对照组；B：TGF-β1处理组；C：TGF-β1+SB-431542处理组；D：SB-431542处理组

图2 荧光显微镜下各组RPE细胞内ALK5蛋白的表达(FITC，×200)。A：对照组；B：TGF-β1处理组；C：TGF-β1+SB-431542处理组；D：SB-431542处理组

2.5 RPE细胞中ALK5、VEGF、α-SMA、ColⅠ、FN蛋白的表达 不同组别RPE细胞中ALK5、VEGF、α-SMA、ColⅠ、FN蛋白的表达见图4。结果表明，与对照组比较，TGF-β1处理组、TGF-β1+SB-431542处理组ALK5、VEGF、α-SMA、ColⅠ、FN蛋白表达差异均有统计学意义(F=60.82、64.17、120.74、81.92、94.23，均为P<0.05)；与对照组相比，SB-431542处理组各种蛋白表达差异均无统计学意义(均为P>0.05)。TGF-β1处理组ALK5、VEGF、α-SMA、ColⅠ、FN蛋白相对表达量分别是对照组的(3.69±0.37)倍、(1.76±0.05)倍、(2.58±0.18)倍、(1.86±0.11)倍、(1.74±0.08)倍，差异均有统计学意义(t=12.72、25.79、15.26、12.98、15.18，均为P<0.05)。TGF-β1+SB-431542 处理组ALK5、VEGF、α-SMA、Col Ⅰ、FN蛋白相对表达量均低于TGF-β1处理组，分别是TGF-β1处理组的(67.73±5.15)%、(71.71±3.50)%、(79.87±0.05)%、(63.59±3.16)%、(83.07±2.31)%，差异均有统计学意义(t=10.85、13.99、6.57、19.97、12.70，均为P<0.05)。

图3 各组RPE细胞迁移情况。1：对照组；2：TGF-β1处理组；3：TGF-β1+SB-431542处理组；4：SB-431542处理组

图4 Western blot 检测各组RPE细胞ALK5、VEGF、α-SMA、Col Ⅰ、FN蛋白的相对表达。A：电泳图；B：各蛋白相对表达量。1：对照组；2：TGF-β1处理组；3：TGF-β1+SB-431542处理组；4：SB-431542处理组。与其余各组相比，#P<0.05

3 讨论

正常人RPE细胞是一种静止的单层细胞。在体外培养和损伤修复时保持一种潜在的分化增殖能力，如受到轻微刺激时，RPE细胞会迅速增殖；当受到较严重的损伤时，如视网膜脱离等情况下，RPE细胞可能脱落在玻璃体内中，在新的环境下发生细胞去极化和表型变化，呈现成纤维细胞样外观，并保持增殖和迁移的能力[13-15]。正是通过这种过度的创伤后修复反应，RPE细胞得以增生、迁移和修复视网膜缺损，这就是早期PVR形成的重要原因[16]。而TGF-β1是RPE细胞发生增殖和迁移最重要的因素，其作用贯穿了RPE细胞的增殖、分化、转移、黏附以及纤维增殖膜的收缩[12，17-18]。本研究发现，体外培养的人RPE细胞给予0.1 μg·L-1TGF-β1时细胞增殖速度即增加，在一定浓度范围内RPE细胞增殖率随TGF-β1浓度增加而增加。给予10 μg·L-1TGF-β1刺激后RPE细胞形态发生明显变化，由生长规则的多角形细胞转分化为更具侵袭性的长梭形，相邻细胞之间失去接触，且细胞增殖速度加快、迁移程度增加。这是因为TGF-β1可使增殖的RPE细胞失去极性，发生上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，产生大量胶原蛋白等细胞外基质(extracellular matrix，ECM)成分[9，11]。ECM可在视网膜前后表面及玻璃体内形成具有收缩能力的纤维增殖膜，Feist等[6]研究发现，PVR患者的纤维增殖膜中至少一半的肌成纤维细胞来源于转分化的RPE细胞。因此，抑制RPE细胞纤维化可有效抑制PVR的发生和发展[5-6]。

本实验结果显示，给予10 μg·L-1TGF-β1刺激24 h后，与对照组相比，RPE细胞内VEGF、ALK5、α-SMA、ColⅠ及FN蛋白表达均上调，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。上述实验结果符合转分化后的RPE细胞特性，表明TGF-β1是RPE细胞发生EMT的重要诱因。首先，TGF-β1上调RPE细胞内促进新生血管形成的因子如VEGF的表达，促进视网膜新生血管形成。随着病史延长，VEGF与其受体结合引起RPE细胞增殖和迁移[19]。TGF-β1通过刺激ECM的积累加速RPE细胞纤维化的发展，并通过TGF-βⅠ型受体，即ALK5，使Smad2和Smad3蛋白磷酸化并将信号转导至细胞核[20-21]，促进RPE细胞的增殖和迁移。这都为PVR患者纤维增殖膜的形成提供了有利的物质条件。此外，TGF-β1刺激RPE细胞发生EMT，产生大量ECM成分。胶原构成ECM的骨架结构，刺激细胞增殖、诱导细胞分化，PVR的ECM成分主要为ColⅠ和FN[22]。在正常情况下，RPE细胞仅能分泌少量的ColⅠ，但在PVR患者玻璃体液中TGF-β1表达量增多，RPE细胞微环境发生了变化，ColⅠ的表达也将随之上调[23]，本实验结果与上述结论一致。

SB-431542是ALK5的小分子抑制剂，能够竞争性结合ALK5激酶区的ATP位点而特异性抑制ALK5，通过阻止ALK5磷酸化进一步阻断TGF-β1信号通路中Smad2和Smad3进入细胞核内，最终阻断Smad2/Smad3介导的TGF-β信号通路细胞增殖和迁移作用[12，24]。在本实验中，与TGF-β1处理组细胞相比，给予SB-431542干预后RPE细胞增殖率随SB-431542浓度增加明显降低，迁移程度亦减小，部分RPE细胞成纤维细胞样外观被逆转，RPE细胞内ALK5、VEGF、α-SMA、ColⅠ及FN蛋白相对表达水平均有所下降，差异均有统计学意义(均为P<0.05)，说明TGF-β1致RPE细胞发生EMT是一个复杂但可逆的过程。SB-431542可以阻断TGF-β1信号通路，逆转TGF-β1致RPE细胞增殖、迁移和纤维化的作用。而单独给予SB-431542处理时和对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)，则再次印证TGF-β1对RPE细胞的增殖起促进作用，而SB-431542是通过阻断TGF-β1信号通路起作用的。

本研究结果表明，ALK5抑制剂SB-431542可以阻断RPE细胞内TGF-β1介导的信号通路，抑制TGF-β1诱导的RPE细胞增殖、迁移及表型变化，从而减弱RPE细胞纤维化作用。这为临床上有效治疗PVR及减少视网膜脱离复位手术并发症提供了重要依据。