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不同淀粉脱支酶对菠萝蜜种子淀粉分子结构的影响及糊化特性研究

2019-06-11张雨桐张彦军徐飞谭乐和李士泽

热带作物学报 2019年1期
关键词:分子量菠萝蜜淀粉酶

张雨桐 张彦军 徐飞 谭乐和 李士泽

摘  要  采用普魯兰酶和异淀粉酶制备脱支菠萝蜜种子淀粉(debranched jackfruit seed starch,DS)及脱支菠萝蜜种子支链淀粉(debranched jackfruit seed amylopectin,DAP),旨在研究所得DS和DAP之间的差异。结果表明,DS具有较宽的分子量分布,而DAP具有较窄的分子量分布。普鲁兰酶水解α-1,6糖苷键更完全,所以普鲁兰酶DS和DAP平均分子量更低。普鲁兰酶水解较短侧链更有效,异淀粉酶则可水解外分支链。异淀粉酶DAP具有高比例B2链、B3链和长平均链长,导致其具有低的峰值黏度、谷值黏度、崩解值、最终黏度和回生值,但糊化温度高。因此,淀粉脱支酶的选择和直链/支链淀粉组成均能导致淀粉分子结构和糊化特性显著不同(p<0.05),可根据特定需要选择合适制备方法增强或抑制菠萝蜜种子淀粉固有性质或赋予其新的特定性质。

关键词  菠萝蜜种子淀粉;脱支淀粉;普鲁兰酶;异淀粉酶;分子结构;糊化特性中图分类号  TS231      文献标识码  A

Effect of Different Starch Debranching Enzymes on the Molecular Structure of Jackfruit Seed Starch and Pasting Properties

ZHANG Yutong1, ZHANG Yanjun2*, XU Fei2, TAN Lehe2, LI Shize1*

1. College of Food Science, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing, Heilongjiang 163319, China; 2. Spice and Beverage Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Wanning, Hainan 571533, China

Abstract  Debranched jackfruit seed starch (DS) and debranched jackfruit seed amylopectin (DAP) were prepared by pullulanase or isoamylase, and the differences between the DS and DAP was investigated. The results showed that DS had a broad molecular weight distribution while DAP had a narrow molecular weight distribution. Pullulanase DS and DAP had a lower average molecular weight due to more complete hydrolysis of the α-1,6 glycosidic bonds. Pullulanase hydrolysis was more effective for shorter lateral chains, whereas isoamylase could hydrolyze outer branching linkages of amylopectin. Isoamylase DAP had a higher proportion of B2, B3 chains and the longest average chain length, resulting in a lower peak viscosity, trough viscosity, breakdown, final viscosity and setback, but a higher gelatinization temperature. Therefore, both the selection of starch debranching enzymes and the amylose/amylopectin composition could lead to the significant differences (p<0.05) in the molecular structure and pasting properties. According to the specific needs, the appropriate methods could be used to enhance or inhibit the inherent properties of jackfruit seed starch or endow it new specific properties.

Keywords  jackfruit seed starch; debranched starch; pullulanase; isoamylase; molecular structure; pasting properties

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.01.022

菠萝蜜(Artocarpus heterophyllusLam.)为桑科(Moraceae),是热带地区典型常绿树种之一[1]。千年之前被引入中国,主要栽培在我国海南、广东、广西、云南和四川南部的热带、亚热带地区以及南亚热带地区[2]。菠萝蜜是世界上最大的可食用水果,由外皮、黄色果肉、鳞茎和种子组成。种子占果实总重的8%~15%[1],富含大量淀粉,占干物质的60%~80%[3]。菠萝蜜种子淀粉(jackfruit seed starch,JFSS)的研究利用仍处于初级阶段,虽对JFSS的性质进行了研究,验证了其在食品和其他用途中的适用性[4],但JFSS的分子结构还需进一步研究。

淀粉分子结构一直是食品科研人员的研究重点,主要包括淀粉精细结构,支链链长分布是最普遍的精细结构分析之一[5]。目前有关JFSS分子结构报道较少,Zhang等[1]报道了JFSS直链和支链淀粉平均分子量,表明分子大小随直链和支链淀粉平均分子量增加而增加。Zhang等[1]研究了普鲁兰酶脱支菠萝蜜种子支链淀粉(debranched jackfruit seed amylopectin,DAP),发现高比例A链可形成致密结构,高比例B2和B3链与平均链长相关。Luciano等[6]选取异淀粉酶脱支JFSS(debranched JFSS,DS),发现软JFSS的A链比例低于硬JFSS,B1、B2、B3链和平均链长高于硬JFSS。目前,DS和DAP的平均分子量尚未见报道,JFSS链长分布虽存在少量研究,但淀粉脱支酶的选择却不统一,对淀粉或支链淀粉进行水解也存在不一致性。

本研究中,以JFSS及支链淀粉作为原料,通过高性能体积排阻色谱-多角度激光散射检测器-示差折光檢测器(high-performance size exclusion chromatography-multi-angle laser light-scattering detector-refractive index detector,HPSEC-MALLS- RI)联用系统分析DS和DAP分子量特征,采用高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测器(high-per for mance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection,HPAEC-PAD)确定DS和DAP链长分布,并且利用快速黏度分析仪(rapid visco analyzer,RVA)测定DS和DAP糊化特性,以确定不同淀粉脱支酶对DS和DAP分子结构和糊化特性的影响,为JFSS的进一步研究提供理论基础。

1  材料与方法

1.1材料

1.1.1  植物材料与试剂  菠萝蜜种子由中国热带农业科学院香料饮料研究所提供,为马来西亚引进品种。普鲁兰酶,美国Sigma公司;异淀粉酶,爱尔兰Megazyme公司;二甲基亚砜(色谱纯),德国Meker公司;葡聚糖标准品T40,美国Sigma公司;醋酸钠(色谱纯),美国Dionex公司;氢氧化钠(色谱纯),德国Meker公司。其他试剂均为国产分析纯。

1.1.2  仪器与设备  HPSEC-MALLS-RI高效液相色谱系统(配有多角度激光光散射检测器、示差折光检测器及Astra 5.3.4数据处理系统):美国Waters公司;HPAEC-PAD高效液相阴离子色谱系统(配有脉冲安培检测器及Chromeleon 6.8色谱工作站):美国Dionex公司;TechMaster快速黏度分析仪:瑞典perten仪器公司;LXJ-IIB离心机:上海安亭科学仪器厂;Scientz-18ND冷冻干燥机:宁波新芝生物科技股份有限公司;SHZ-C水浴恒温振荡器:上海博迅实业有限公司医疗设备厂;Blue pard电热恒温鼓风干燥箱:上海一恒科学仪器有限公司;SY-100C脱壳机:台州市鲨鱼食品机械有限公司;HX-PB908多功能磨浆机:佛山市海迅电器有限公司;80胶体磨:上海科劳机械厂。

1.2方法

1.2.1  制备菠萝蜜种子淀粉  种子置于50 ℃干燥箱,外壳略干、内种衣湿润时取出并去除。种仁加蒸馏水于磨浆机粉碎,粗浆与蒸馏水1∶3混合,胶体磨细磨5 min。过200目筛后水洗,5000 r/min离心10 min,沉淀与0.5 mol/L硫代硫酸钠1∶1混合搅拌36 h。再次离心,刮去沉淀上层褐色皮并水洗,用1.0 mol/L盐酸中和至pH 7.0,离心,沉淀用50%无水乙醇洗涤。所得JFSS于50 ℃冷冻干燥至水分含量<13%[3]

1.2.2  分离菠萝蜜种子支链淀粉  JFSS加蒸馏水配成质量分数3%的溶液,于100 ℃水浴摇床1 h。5000 r/min离心10 min,沉淀加蒸馏水配成质量分数3%的溶液,于100 ℃水浴摇床1 h,再次离心去除残留直链淀粉,沉淀加甲醇配制成质量分数80%的溶液,涡旋2 min,离心,沉淀为支链淀粉。所得支链淀粉于50 ℃冷冻干燥至水分含量<13%[1]

1.2.3  测定分子量分布  JFSS或支链淀粉22.5 mg分别溶于二甲基亚砜溶液0.3 mL(色谱纯),100 ℃加热10 min后沸水浴10 min。冷却后,加1.5 mL醋酸钠缓冲溶液(1.0 mol/L,pH 4.0),5 μL普鲁兰酶或异淀粉酶(1000 U/mL),40 ℃水浴24 h脱支,取出后沸水浴灭酶20 min。DS和DAP以12 000 r/min离心10 min,上清液过0.22 μm聚四氟乙烯滤膜[7]

流动相:50 mmol/L硝酸钠-二甲基亚砜,超声20 min;流速:0.6 mL/min;色谱柱:Styragel HMW 6E DMF和HMW 2 MF串联;柱温:45 ℃;RI检测器:40 ℃;进样量:100 μL。葡聚糖标准品:T40,2 mg/mL,用于MALLS中检测器归一化[7]。采用Astra 5.3.4软件采集分析光散射数据和示差检测器信号。曲线拟合用采二阶Berry模型,计算重均分子量(weight average molecular weight,Mw)、数均分子量(number average molecular weight,Mn)、平均旋转半径(average radius of gyration,Rg)和多分散性(polydis persit

-yindices,PI)[7]

1.2.4  测定支链淀粉精细结构  JFSS或支链淀粉40 mg,加2 mL醋酸钠缓冲溶液(50 mmol/L,pH 6.0),沸水浴30 min,55 ℃水浴10 min,加5 μL普鲁兰酶或异淀粉酶(1000 U/mL),55 ℃水浴24 h,沸水浴灭酶20 min,冷却后12 000 r/min离心10 min,取上清液,過0.45 μm水系滤膜,稀释10倍进样[1]

流动相:屈臣氏蒸馏水(A),0.25 mol/L氢氧化钠(B),0.1 mol/L氢氧化钠+1 mol/L醋酸钠(C);流速:0.5 mL/min;色谱柱:Cabo Pac PA20(3 mm× 150 mm)分析柱和Carbo Pac PA20(3 mm×30 mm)保护柱;柱温:30 ℃;进样量:10 μL;脉冲积分安培检测:Au工作电极,Ag/AgCl参比电极,检测电位波形为标准四电位波形[1]。采用峰值分析软件确定A、B1、B2和B3链聚合度所占比例[8]。1.2.5  测定糊化特性  JFSS或支链淀粉3.0 g与25 mL蒸馏水混合,在RVA容器中960 r/min搅拌10 s,然后以160 r/min进行剩余程序。50 ℃保持1 min后,以6 ℃/min加热至95 ℃并保持5 min,以6 ℃/min冷却至50 ℃并保持2 min。记录糊化参数峰值黏度、最低黏度、崩解值、最终黏度、回生值和糊化温度[3]

1.3数据处理

采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析,p<0.05为显著;采用Origin 8.5软件绘图。

2  结果与分析

2.1分子量分布

DS和DAP的平均分子量分布如图1和图2所示,基于Berry拟合模型计算的Mw、Mn、Rg和PI如表1所示。观察到DS和DAP的Mw、Mn、Rg和PI存在显著差异(p<0.05)。DS和DAP的Mw、Mn、Rg和PI分别是2.37×106~4.41× 106g/mol、1.24×106~2.94×106g/mol、80.7~99.4 nm和1.5~1.9。

2.2 支链淀粉分支链长分布

分支链长分布常用的分配方式为A链(DP 6-12)、B1链(DP 13-24)、B2链(DP 24-36)和B3链(DP≥37)[9],此种分配方式被用于异淀粉酶脱支处理,因为异淀粉酶不能水解由2~3个葡萄糖残基构成的侧枝[10]。普鲁兰酶可以水解较短的侧链(麦芽糖或麦芽三糖)[11],所以分配方式为A链(DP 2-12),其余相同。

DS和DAP的分支链长分布如图3和图4所示,比例分配结果如表2所示。DS和DAP的分支链长分布观察到显著差异(p<0.05)。DS和DAP的A链、B1链、B2链和B3链分别为39.84%~ 44.18%、37.95%~39.63%、13.26%~18.94%和2.93%~ 3.27%。平均链长为链长分布的平均值,DS和DAP平均链长为DP 17.02~18.66。

2.3 糊化特性

DS和DAP的糊化参数如表3所示。DS和DAP的糊化特性观察到显著差异(p<0.05)。DS和DAP的峰值黏度、谷值黏度、崩解值、最终黏度、回生值和糊化温度分别为156~338 cP、105~ 236 cP、50~102 cP、424~689 cP、120~234 cP和50.15~62.47 ℃。

3讨论

DS的Mw、Mn和Rg均高于DAP的Mw、Mn和Rg。Cai等[12]的研究表明,蜡质淀粉产生的线性直链分子具有较窄的分子量分布,含直链的淀粉(如普通淀粉和高直链淀粉)产生的线性直链分子具有较宽的分子量分布。普鲁兰酶DS和DAP的Mw、Mn和Rg均低于异淀粉酶DS和DAP的Mw、Mn和Rg,这是由于普鲁兰酶水解α-1,6糖苷键完全,导致分子量明显下降[13]。普鲁兰酶能专一性切开支链淀粉分支点中α-1,6糖苷键,将最小单位的支链分解,使水解产物中含有更多游离线性直链淀粉分子,最大限度利用淀粉原料[14];而異淀粉酶虽然也能水解糖原或支链淀粉分枝点的α-1,6糖苷链,形成长短不一的线性直链淀粉分子,但是却不能水解由2~3个葡萄糖残基构成的侧枝[10]。Zhang等[15]的研究表明,JFSS的Mw、Mn、Rg和PI分别是1.74×107~4.61× 107g/mol、1.10×107~2.34×107g/mol、115.4~144.2 nm和1.4~ 2.0。Zhang等[1]报道,JFSS支链淀粉的Mw、Mn、Rg和PI分别为2.51×107~6.74×107g/mol、1.87×107~5.36×107g/mol、94.6~136.5 nm和1.21~ 1.41。对比前人研究结果,DS和DAP平均分子量较正常JFSS及支链淀粉平均分子量明显降低,是由于普鲁兰酶和异淀粉酶通过水解α-1,6糖苷键,导致其形成低分子量的线性直链分子[16-17]。普鲁兰酶脱支甘薯淀粉的Mw、Mn和PI分别是3.07×107~3.09×107g/mol、2.81×105~3.00×105g/mol和10.31~10.92[18],普鲁兰酶脱支蜡质大米淀粉的Mw、Mn、Rg和PI分别是3.19×105g/mol、6.12×104g/mol、22.80 nm和5.33[19],异淀粉酶脱支马铃薯、小麦、玉米和蜡质玉米淀粉的Mw和Rg范围是2.5×104~3×105g/mol和5~20 nm[20]。对比前人研究结果,普鲁兰酶DS的Mw、Mn和PI低于普鲁兰酶脱支甘薯淀粉;普鲁兰酶DAP的Mw、Mn和Rg高于普鲁兰酶脱支蜡质大米,但PI低于普鲁兰酶脱支蜡质大米;异淀粉酶DS和DAP的Mw和Rg高于异淀粉酶脱支马铃薯、小麦、玉米和蜡质玉米淀粉。不同植物来源、种植环境和淀粉组成均能导致平均分子量显著不同[21]

DS的A链和B1链高于DAP,但B2链和B3链低于DAP,可能是由于JFSS中含直链淀粉,DS产生线性直链淀粉分子与JFSS中原有直链淀粉结合,因此与DAP存在差异。Tester等[22]报道了淀粉中直链/支链淀粉组成强烈影响其对酶水解的敏感性。普鲁兰酶DS和DAP的A链和B1链分别高于异淀粉酶DS和DAP的A链和B1链,是由于普鲁兰酶水解反应对于较短的侧链更有效[11],水解后短链含量明显增加[23]。普鲁兰酶DS和DAP的B2链和B3链分别低于异淀粉酶DS和DAP的B2链和B3链,是由于普鲁兰酶难以切割更长侧链,水解长链相对困难[11]。因此,不同淀粉脱支酶和不同直链/支链淀粉组成均能导致链长分布显著不同。异淀粉酶DAP平均链长最长,普鲁兰酶DS平均链长最短,Zhang等[1]报道最长的平均链长与高比例的B2链和B3链直接相关。大米淀粉A链、B1链、B2链、B3链和平均链长范围是17.3%~19.4%、57.4%~58.9%、12.7% ~14.0%、10.0%~10.9%和DP 20.6~21.2[24]。蜡质玉米A链、B1链、B2链、B3链和平均链长范围是37.27%、38.79%、11.49%、12.46%和DP 19.65[25]。对比前人研究结果,大米淀粉A链和B2链小于DS,B1链、B3链和平均链长大于DS;蜡质玉米的A链、B1链和B2链小于脱支DAP,B3链和平均链长大于DAP。不同的植物来源、淀粉组成、水解条件等均会造成上述差异[25-26]

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