基于ISSR标记的咖啡资源遗传多样性分析

闫林 黄丽芳 王晓阳 周华 程金焕 李锦红

摘  要  采用ISSR分子标记对87份咖啡资源进行遗传多样性和亲缘关系分析。结果表明，19条ISSR引物扩增出140条带，其中多态性带107条，多态性位点为76.4%。运用UPGMA方法构建了聚类图，在遗传相似系数0.625水平下，87份资源被分为3大类。第Ⅰ类群包括了3份大粒种（Coffea liberica Bull ex Hiern）;第Ⅱ类群为中粒种咖啡（C. canephora Pierre）;第Ⅲ类群包括了全部小粒种资源（C. arabica Linne），共83份。咖啡种质的遗传关系种间容易划分，在种的分类水平上存在遗传关系多样性，而小粒种咖啡种内遗传多样性较窄。该研究结果将为咖啡种质鉴定、分类及分子育种提供重要科学依据。表明用ISSR分子标记进行咖啡资源遗传多样性的分析是可行的。

关键词  咖啡;ISSR;聚类分析;遗传多样性

中图分类号  S571.2      文献标识码  A

咖啡（Coffea spp.）为茜草科（Rubiaceae）咖啡属（Coffea）多年生常绿灌木或小乔木。咖啡属的种类约有124种，主要分布在世界热带和亚热带地区[1-2]。商业栽培的主要有阿拉比卡中咖啡（Coffea arabica L.，俗称小粒种咖啡）和罗布斯塔咖啡（Coffea Canephora Pierre，俗称中粒种咖啡）。小粒种咖啡是咖啡属中唯一的同源四倍体物种（2n=4x=44），其余的均是二倍体[3-4]。小粒种咖啡是中粒种咖啡和C. eugenoedes或其他生态型较近的二倍体杂交后代，原产于埃塞俄比亚中部高原[5-7]。

ISSR（inter simple sequence repeat）分子标记是一种以微卫星序列为引物，进行多位点PCR扩增的技术，ISSR不仅有丰富的多态性，同时具有简便、快速、稳定的特点，广泛地应用于生物的品鉴定[8]、遗传多样性分析[9]、遗传图谱构建[10]、基因定位[11]等方面的研究。在咖啡种质资源鉴定方面也有所应用。Ruas等[12]利用ISSR标记对8个咖啡种进行了遗传多样性分析，结果表明种间遗传差异较大，遗传相似数变幅很大，从racemosa咖啡与大粒种咖啡相似数0.25到阿拉比卡咖啡与N2杂交种的0.86。Aga等[13]利用ISSR标记对来源于埃塞俄比亚4个地区的森林咖啡进行了遗传差异分析，11个标记扩增出123条带，其中25%具有多态性。尽管ISSR标记检测到的多态性位点较少，但仍可作为小粒种咖啡群体的特征性分子标记。ISSR标记也被用于评价来自坦桑尼亚小粒种咖啡种内的遗传差异，并计算了小粒种咖啡与二倍体咖啡间的遗传相似指数[14]。利用ISSR标记对来自印度的4个Psilanthus种和来自非洲的15个咖啡种进行分析，这2种标记均表明在印度Psilanthus种和非洲咖啡间存在明显差异[15]。ISSR标记也更有效的揭示了DRC组织中粒种咖啡内存在遗传变异[16]。Kassahun等[17]利用9个ISSR标记分析了来自埃塞俄比亚的125份野生种和地方品种，鉴别了野生咖啡与地方品种的区别，并认为小粒种咖啡在异源多倍体化后，由于最近或古老的基因流动，从逐步延伸的范围延伸出来的野生咖啡基因型的分级地理模式被模糊了。

我国引种咖啡100多年，收集保存了大量种质资源，前期也开展了资源鉴定评价，但主要集中于表型鉴定评价研究[18]。随着生物技术的发展，借助分子技术进行鉴定评价是最为可靠而快捷的方法。黄丽芳等[19-22]利用RAPD技术分析了我国咖啡资源的多样性，明确了其亲缘关系，表明该标记可以用于咖啡种质的鉴别。国外已有利用ISSR标记进行咖啡资源遗传多样性分析的研究，但对于我国收集保存的咖啡资源还未见报道，而且我国收集保存了来源于世界20多个国家的咖啡资源，其亲缘关系如何、遗传多样性是否丰富还未能明确，不利于后续的资源评价与创新利用工作。因此，本研究利用ISSR分子标记技术，对云南收集保存的来自不同国家的87份资源进行多样性分析，旨在揭示其亲缘关系，从而为咖啡种质资源的收集、鉴定、资源保护和遗传育种提供科学依据。

1  材料与方法

1.1  材料

供试材料为87份咖啡种质资源（表 1），分别来源于中国、葡萄牙、墨西哥、肯尼亚等22个国家，其中小粒种83份，中粒种1份，大粒种3份。编号1-63取自云南德宏热带农业科学研究所瑞丽咖啡种质资源圃（云南德宏），编号64-70取自云南省普洱市，编号71-87取自云南省农业科学院热带亚热带经济作物研究所（云南保山）。

1.2  方法

1.2.1  基因组DNA的提取  基因组DNA的提取参照黄丽芳等[23]的CTAB改良法。提取的基因组DNA经1.0% 琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度计检测质量，稀释至20 ng/μL，备用。

1.2.2  ISSR-PCR扩增及引物筛选  ISSR反应体系及扩增程序参照闫林等[24]的方法。PCR 产物加入3 μL溴酚蓝缓冲液，通过1.5% 琼脂糖凝胶电泳观察。

ISSR所用引物为加拿大哥伦比亚大学（UBC Primer Set #9）公布的100个引物序列，以4份差异较大的咖啡（27号、台湾小粒、大粒、M10）基因组DNA为模板，按照优化的反应条件筛选多态性好且扩增条带清晰的引物19条用于本试验（表2）。

1.3  数据分析

根据扩增产物在琼脂糖凝胶中迁移率，对电泳结果统计。按照有（1）和无（0）记錄谱带，重复性、清晰度好的扩增条带赋值“1”，无条赋值“0”，构建原始数据矩阵。采用NTSYSpc 2.1软件进行主坐标分析，计算遗传相似系数GS（genetic similarity），采用非加权算术平均法（UPGMA）进行聚类分析。

2  结果与分析

2.1  扩增产物多态性

利用4份（27号、台湾小粒、大粒、M10）差异较大的咖啡样本扩增，从100条ISSR引物中筛选出扩增条带清晰、重复性高的引物19条。利用筛选出的19条引物对87份样品进行多样性分析（图1），共检测到140个位点，不同引物扩增带数3～13条不等，平均每条引物扩增7.4条带，DNA片段大小分布在170～2100 bp。多态性位点107条，占总条带的76.4%，多态性条带数量在1～11条。

2.2  遗传相似系数

应用NTSYS软件计算87份咖啡材料间遗传相似系数（GS），得到相似性矩陣（表3）。87份材料间的遗传相似系数为0.430～0.991，平均值为0.689。根据遗传相似系数可判断不同种质亲缘关系远近，从表3可以看出，所有种质间均存在不同程度的遗传差异。夏威夷-1（大叶）与夏威夷-2遗传相似系数最大，为0.991，表明遗传距离最近，遗传差异最小;大粒种-1与P2、危地马拉、坦桑尼亚遗传相似系数均最小，为0.430，表明遗传距离最远，遗传差异最大。

2.3  聚类分析

采用UPGMA进一步对87份咖啡材料进行聚类分析（图2）。在遗传相似系数0.625水平下，可把87份资源分为3大类。第Ⅰ类群包括3份大粒种，在0.786处，采集自热经所的2份大粒种又聚为一类，说明二者亲缘关系更近;第Ⅱ类群为1份种质，为来自云南省农业科学院热带亚热带经济作物研究所的中粒种咖啡;第Ⅲ类群包括了来自哥伦比亚、葡萄牙、巴西、墨西哥、中国云南等21个国家及地区的83份小粒种咖啡。

似系数在0.666～0.991之间，说明小粒种咖啡种质间亲缘关系较近，遗传距离小;在相似系数0.714处，又可分为3个分支，其中一支为杂交种和矮卡2，一支为德热132、巴西2、巴西3共3份资源，剩余的来自巴西、墨西哥、哥伦比亚等地共78份种质聚为一类。

2.4  主坐标分析

通过对87份咖啡资源的ISSR数据矩阵进行主坐标分析，以排在前3位的矩阵特征值为坐标，制成三维分布图（图3）。各特征值的贡献指数分别占48.92%、16.57%、14.43%，累计贡献指数为79.93%。不同维度上种质距离的大小代表着种质间的疏密程度，进而揭示种质间的亲缘关系[25]。图中展示出通过主坐标将87份种质分为3大组，表明能够聚集在一起的各组种质间遗传关系更近，且主坐标分析与系统聚类分析结果一致。

3  讨论

种质资源遗传多样性是生物多样性的基础，所有的遗传多样性都是发生在基因水平，遗传变异的产生，形成了丰富的遗传多样性[26-27]。有效的收集、保存、评价和利用咖啡种质资源对于咖啡产业的可持续性发展具有重要的意义。随着生物技术的发展，咖啡资源的准确鉴定和相关研究的进一步深化。相似系数是描述2个指标或2个样品间相似程度的度量参数，相似系数越大，材料间相似程度就越高，遗传背景一致性也就越强。本研究通过Nei-Li相似系数法计算出87份咖啡材料的遗传系数为0.430～0.991，平均遗传相似系数为0.689，表明不同咖啡材料间存在着丰富的多态性。在0.625水平下，可将87份咖啡资源分为3大类，ISSR标记可为咖啡种质的分类研究提供更多的信息。83份小粒种咖啡资源都聚在第Ⅲ类群，遗传相似性系数0.666～0.991，遗传相似系数较高，这与小粒种咖啡为自花授粉有关，所以种内遗传亲缘关系较近，具有相对较高的遗传一致性。Anthony等[5]利用AFLP和SSR分析小粒种野生与栽培种资源，半野生小粒种的多态性比栽培种高，但整体小粒种遗传多样性不明显。Ma sum buko等[28]研究结果表明栽培小粒种咖啡资源亲缘关系较近，遗传差异小。黄丽芳等[20]利用RAPD对我国收集保存的咖啡资源进行分析，结果也表明小粒种咖啡资源遗传多样性较窄，这些与本试验的结果较一致。这一方面与小粒种咖啡为自花授粉作物有关，另一方面也与我国现有小粒种咖啡种质资源大多为国外引进的栽培种，而野生种质引进较少有关，而且这些外引品种的育种亲本范围较为狭窄。

种质资源的遗传关系相似程度与资源来源地和栽培环境具有一定的相关性[29-31]。小粒种资源小叶夏威夷-1、大叶夏威夷-1和夏威夷-2，CATMOR P90、CATIMOR P127、CATMOR P128、CATIMOR P134、CATIMOR P130，哥斯达黎加-1、哥斯达黎加-3、哥斯达黎加-4，巴西-2和巴西-3及2份云南省农业科学院热带亚热带经济作物研究所的大粒种资源等部分来源相近的种质间表现出较近的亲缘关系。但也有资源偏离所属国家（地区）的现象，如来自肯尼亚的CATIMOR P88、CATIMOR P129分别与其他资源聚为2个分支，哥斯达黎加-2与其他资源聚为一个分支，说明同一地区的种质间存在遗传差异，这可能与广泛的种质起源以及漫长的进化有关，也可能是长期人工选育的结果。

咖啡种质资源创新利用的最终目的是培育优良新品种，提高咖啡的产量、品质，促进产业可持续发展。明确咖啡种质资源的亲缘关系是资源利用的基础。本研究通过ISSR标记分析结果表明，87份咖啡种质资源存在遗传关系多样性，在种的分类水平上存在遗传差异，而在小粒种咖啡种内遗传多样性较窄。该研究结果将为咖啡种质鉴定、分类及分子育种提供重要科学依据。ISSR分子标记进行咖啡资源遗传多样性的分析是可行的。

参考文献

Davis AP， Tosh J， Ruch N， et al. Growing coffee： Psilanthus （Rubiaceae） subsumed on the basis of molecular and morphological data; implications for the size， morphology， distribution and evolutionary history of Coffea[J]. Botanical Journal of the Linnean Society， 2011， 167： 357-377.

Ceja-Navarro J A， Vega F E， Karaoz U， et al. Gut microbiota mediate caffeine detoxification in the primary insect pest of coffee[J]. Nature Communication， 2015， 6（7618）： 1-9.

Stoffelen P， Noirot M， Couturon E， et al. Coffea anthonyi; a new self-compatible Central African coffee species， closely related to an ancestor of Coffea arabica[J]. Taxon， 2009， 58（1）： 133-140.

Nowak M D， Davis A P， Anthony F， et al. Expression and trans-specific polymorphism of self-incompatibility rnases in Coffea （Rubiaceae）[J]. PLoS One， 2011， 6（6）： 1-11.

Anthony F， Combes C， Astorga C， et al. The origin of cultivated Coffea arabica L. varieties revealed by AFLP and SSR markers[J]. Theoretical & Applied Genetics. 2002， 104（5）： 894-900.

Silvestrini M， Junqueira M G， Favarin A C， et al. Genetic diversity and structure of Ethiopian， Yemen and Brazilian Coffea arabica L. accessions using microsatellites markers[J]. Genetic Resources and Crop Evolution， 2007， 54（1）： 1367-1379.

Cenci A， CombesM C， Lashermes P. Genome evolution in diploid and tetraploid coffea species as revealed by comparative analysis of orthologous genome segments[J]. Plant Molecular Biology， 2012， 78（1）： 135-145.

Culley T M， Wolfe A D. Population genetic structuer of the cletstogamous plant species Viola pubescens Aiton （Vilaceae）， as indicated by allozyme and ISSR molecular markers[J]. Heredity， 2001， 86 （5）： 545-556.

朱巖芳， 祝水金， 李永平， 等. ISSR分子标记技术在植物种质资源研究中的应用[J]. 种子， 2010， 29（2）： 55-59.

易  克， 徐向利， 卢向阳， 等. 利用SSR和ISSR标记技术构建西瓜分子遗传图谱[J]. 湖南农业大学学报（自然科学版）， 2003， 29（4）： 333-337.

李冬梅. 饲草型小黑麦的遗传图谱构建及草产量和抗锈病相关基因的QTL定位[D]. 兰州： 甘肃农业大学， 2016.

Ruas P M， Ruas C F， Rampim L， et al. Genetic relationship in coffea species and parentage determination of interspecific hybrids using ISSR （Inter-Simple Sequence Repeat） markers[J]. Genetics and Molecular Biology， 2003， 26（3）： 319-327.

Aga E， Bekele E， Bryngelsson T. Inter-simple sequence repeat （ISSR） variation in forest coffee trees （Coffea arabica L.） populations from Ethiopia[J]. Genetica， 2005， 124（2-3）： 213-221.

Masumbuko L I， Bryngelsson T. Inter simple sequence repeat （ISSR） analysis of diploid coffee species and cultivated Coffea arabica L. from Tanzania[J]. Genetic Resources and Crop Evolution， 2006， 53（2）： 357-366.

Kumar S A， Sudisha J， Sreenath H L. Genetic relation of Coffea and Indian Psilanthus species as revealed through RAPD and ISSR markers[J]. International Journal of Integrative Biology， 2008， 3（3）： 150-158.

Tshilenge P， Nkongolo K K， Mehes M， et al. Genetic variation in Coffea canephora L.（Var. Robusta） accessions from the founder gene pool evaluated with ISSR and RAPD[J]. African Journal of Biotechnology， 2009， 8（3）： 380-390.

Kassahun T， Kim G， Endashaw B， et al. ISSR fingerprinting of Coffea arabica throughout Ethiopia reveals high variability in wild populations and distinguishes them from landraces[J]. Plant Systematics and Evolution， 2014， 300（5）： 881-897.

周  华， 张洪波， 夏红云， 等. 咖啡种质资源多样性研究[J]. 中国热带农业， 2015， 5： 48-52.

黄丽芳， 董云萍， 王晓阳， 等. 利用RAPD标记分析咖啡种质资源的遗传多样性[J]. 热带作物学报， 2014， 35（12）： 2313-2319.

黄丽芳， 董云萍， 王晓阳， 等. 云南咖啡资源遗传多样性的RAPD分析[J]. 中国热带农业， 2017， 5： 48-52.

黄丽芳， 董云萍， 王晓阳， 等. 咖啡种质资源DNA指纹图谱的构建[J]. 热带农业科学， 2016， （36），12： 48-52.

黄丽芳， 闫  林， 董云萍， 等. 咖啡叶片DNA提取方法的比较研究[J]. 热带农业科学， 2011， （31）， 12： 42-45.

闫  林， 黄丽芳， 谭乐和， 等. 咖啡ISSR与RAPD-PCR反应体系优化[J]. 热带作物学报， 2012， 33（5）： 854-859.

王  野， 陈  磊， 白  云， 等. 云杉矮槲寄生遗传多样性的ISSR分析[J]. 西北植物学报， 2017， 37（11）： 2153-2162.

时圣明， 潘明佳， 王  洁， 等. 分子鉴定技术在中药中的应用[J]. 中草药， 2016， 47（17）： 3121-3126.

马克平. 试论生物多样性的概念[J]. 生物多样性， 1993， 1（1）： 20-22.

郑勇民， 张旭业， 徐秉良， 等. 美洲南瓜种质资源遗传多样性的ISSR分析[J]. 甘肃农业大学学报， 2017， 6： 76-82.

Masumbuko L I， Bryngelsson T， Mneney E E. Genetic diversity in Tanzanian Arabica coffee using random amplified polymorphic DNA （RAPD） markers[J]. Hereditas， 2010， 139（1）： 56-63.

Rotondi A， Magli M， Ricciolini C， et al. Morphological andmolecular analyses for the characterization of a group of Italyolive cuhivars[J]. Euphytica， 2003， 132（2）： 129-137.

陈海云， 宁德鲁， 李勇杰， 等. 59 个油橄欖种质的ISSR分子鉴定[J]. 东北林业大学学报， 2013， 41（3）： 13-17.

席春奕， 唐  茜， 吴永胜， 等. 30份四川茶树种质资源遗传多样性与亲缘关系的SRAP分析[J]. 贵州农业科学， 2013， 41（2）： 6-9.