CRISPR—Cas9系统在农作物中的研究进展

张青霞 吴龙芬 苗贵东

摘 要：从技术发展、原理及应用等方面进行阐述，并对CRISPR-Cas9应用前景进行展望，旨在为农作物的基因功能研究提供一定的参考价值。

关键词：农作物；Cas9系统；RNA干扰；人工核酸酶技术；基因组

文章编号：1004-7026（2019）01-0111-02 中国图书分类号：D033 文献标志码：A

Cas9系统是最新发现的一种可以与分子克隆和PCR等技术相媲美的、简单高效的、由RNA指导的第三代核酸内切酶技术，由相关蛋白、重复序列和间隔序列交替排列组成，使大部分细菌和古细菌避免受外来核酸、噬菌体入侵的一种获得性免疫系统。其设计简单，成本较低，具有特异性、适用范围广、与多位点同时编辑等特点，使研究者实现特定目标基因高效精准的定点敲除、插入和替换[1]，对控制作物重要性状基因的功能鉴定及遗传改良具有巨大的应用潜力。

目前，农作物基因编辑技术主要有ZFNS、TALEN和CRISPR/Cas系统等，其中Ⅱ型CRISPR相关系统应用最多。Cas9系统首次在人类与动物细胞系中建立，经过不断改造后被广泛应用于多种模式生物（线虫[2]、果蝇[3]、水稻[4]等）的基因组学和基因功能等各方面研究中。Cas9系统具有简单性、高效性和多功能性等特点，成為继ZFNs和TALENs之后的第三代SSNs技术。

为顺应农作物全基因组学、基因功能、基因调控机制研究及第二代高通量测序技术的快速发展，烟草、水稻、玉米等作物的基因组测序已顺利完成，为研究者提供比以往更为丰富的遗传信息库。利用Cas9系统调控“产量”相关性状基因，产生有益变异，打破产量壁垒，实现对数量性状的控制，比直接删除或失活其编码蛋白质更可观。因此，开展农作物基因功能研究，揭示其遗传发育规律，发掘和利用遗传资源，培育高产优质、抗病抗虫的最佳品种，具有重要的科学意义与巨大的经济效益。

1 农作物主要基因编辑技术

基因组编辑技术被《Science》评为2012年十大重要科学进展之一，利用基因组编辑技术对植物基因进行改造，是进行农作物遗传改良的重要辅助手段。在开展功能基因组分析和反向遗传学研究过程中，诞生了基因重组、RNAi干扰、基因敲降和人工核酸酶技术。目前农作物基因编辑技术主要有转录水平中的转录后调控技术RNAi和核酸水平人工核酸酶技术，当前作物在遗传改良方面应用的人工核酸酶技术主要包括ZFNs、TALEN和CRISPR/Cas系统。

2 农作物基因编辑技术的发展与建立

2.1 RNA干扰技术

RNA干扰是指在进化过程中高度保守，由双链RNA诱发的同源mRNA高效特异性降解的现象，是转录后基因沉默的机制，在基因功能研究和药物开发中具有重要作用。CropDesiRn公司通过RNA干扰技术，对谷物的个别有益农艺性状基因进行改造，增加谷物的产量，该技术也被用于改造模式生物秀丽线虫的基因组。

2.2 人工核酸酶技术

人工核酸酶技术是最近几年发展起来的一类全新的基因编辑技术。第一代（ZFNs）是由人工改造应用的，含有锌指结构域的转录因子和非特异性的核酸内切酶FokI的切割结构域组成，组装昂贵、设计困难、耗时长等劣势限制其发展。第二代（TALENs）是类转录激活因子效应物DNA结合结构域与非特异性的核酸内切酶FokI的切割结构域相融合，使蛋白质与核苷酸一一对应，比ZFNs更易打靶和组装设计。Li等在2012年利用该技术破坏水稻感病基因Os11N3的启动子序列而提高了水稻的抗病能力。逐步取代ZFNs和TALEN的第三代全新CRISPR/Cas9技术，只需设计和目标核苷酸对应的RNA序列，更易实现多基因编辑优势，广泛应用于生物界各个领域。

1987年日本石野良纯[5]在E.coli碱性磷酸酶序列时发现5个重复成簇间隔短回文结构的DNA片段，后来Jansen[6]利用生物信息工具对这个片段进行命名并分析功能，直到20年后，Barrangou [7]才首次使用CRISPR-associated（Cas）概念并用实验证明CRISPR是与细菌免疫功能有关的结构。CRISPR/Cas9是单个Cas蛋白行使生物学功能，由成熟的反式激活tracrRNA、Cas基因和CRISPR序列区组成，其工作原理是crRNA通过碱基配对与tracrRNA结合形成tracrRNA/crRNA复合物，引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点处剪切双链DNA对基因组DNA序列进行精准编辑。

4 CRISPR-Cas9技术在农作物领域的应用

采用辅助标记选择并构建遗传图谱，通过数量性状定位寻找农作物基因组中的目的基因，该方法育种耗时耗力，且难以鉴定基因功能，但如果将数量性状定位与CRISPR/Cas9技术相结合，就可以对1个或同时对多个基因功能进行精确编辑并控制，省时省力，在农作物品种改良中起到重要作用。高通量二代测序技术的快速发展，使得40多种植物基因组（拟南芥和水稻各2.5万、3～5万个基因）测序完成[8]，获得的大量遗传信息为研究植物适应各种生态环境提供帮助。聂云梦[9]利用CRISPR/Cas9技术构建NtDXR敲除载体，获得DXR基因突变的植株能阻断色素合成，推测该基因参与烟草叶绿素等色素合成。各种生物和非生物胁迫造成产量和品质的重大损失，传统抗病虫育种主要是利用抗病虫杂交育种和诱变育种诱发新的抗病虫基因，但由于作物遗传多样性单一且存在生殖隔离，很难有预期性状的突变体，而利用CRISPR/Cas9技术对植物基因序列进行高效定点剪辑，可以定向育种，培育出高产抗病、抗逆或一些具有特殊应用价值的农作物。2014年高彩霞课题组[10]就是利用CRISPR/Cas9技术首次获得广谱抗白粉病的六倍体小麦。

随着作物轻简化栽培技术和除草剂的广泛使用，培育抗除草剂的作物新品种尤为重要。2015年，杜邦先锋公司利用ALS中特定氨基酸突变提高玉米对乙酰乳酸合酶抑制类除草剂的抗性，是通过Cas9技术将脯氨酸突变为丝氨酸获得抗氯磺隆玉米突变体。夏兰琴团队将ALS编码区特定碱基定点替换，使2个氨基酸变异而获得抗磺酰脲类除草剂的水稻。同时，ENDO也通过类似方法获得ALS编码区W548L和S627I位置处碱基定点替换的水稻突变体，从而提高水稻对乙酰羟酸合酶抑制类除草剂的抗性。最近，SHIMATANI利用CRISPR/Cas9的Target-AID方法将水稻ALS编码区的第96位丙氨基酸突变成缬氨酸，获得抗磺酰脲类除草剂水稻突变体。

总之，通过CRISPR/Cas9系统定点敲除作物抗性负调控因子基因，或定点修饰抗逆性正调控基因的启动子，以增强基因的表达，或对抗性相关基因编码区定点替换改变基因功能，都能在不同程度上改良作物的抗病或抗逆性，是作物抗性分子育种的有效途径。

5 CRISPR/Cas9技术在农作物领域的应用前景

Cas9系统在农作物中的应用已成为一种趋势，由于重要农艺性状的不利基因被发现，Cas9技术必将在遗传改良和作物育种上发挥重大作用。但由于CRISPR技术存在脱靶效应及如何合理设计sgRNA等限制因素，全基因组筛选工作处于初级阶段，有待改善。虽然转基因育种已有多年历史且在多个国家种植，但令人担忧的是转基因的生物安全问题。美国认为基因编辑诱导的突变与自然突变以及物理和化学诱导突变性质相同，即通过CRISPR/Cas9技术创制的抗褐化双孢菇不属于转基因育种。即使存在劣势，也比其他分子技术在植物基因功能研究和作物遗传改良上更有优势。

参考文献：

[1]景润春，卢洪.CRISPR/Cas9基因组定向编辑技术的发展与在作物遗传育种中的应用[J].中国农业科学，2016，49（7）：1 219-1 229.

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[5]IshinoY，ShinagawaH，MakinoK，etal.Nucleotidesequenceoftheiapgene，responsibleforalkalinephosphataseisozymeconversioninEscherichiacoli，andidentificationofthegeneproduct.[J].JournalofBacteriology，1987，169（12）：5 429-5 433.

[6]JansenR，vanEmbdenJD，GaastraW，etal.Identificationofanovelfamilyofsequencerepeatsamongprokaryotes[J].OmicsAJournalofIntegrativeBiology，2002，6（1）：23.

[7]BarrangouR，FremauxC，DeveauH，etal.CRISPRProvidesAcquiredResistanceAgainstVirusesinProkaryotes[J].Science，2007，315（5 819）：1 709.

[8]吳健，刘学，王永红.植物重要功能基因研究进展及其应用[J].生命科学，2011，23（2）：168-178.

[9]聂梦云，高军平，罗培，等.基于CRISPR/Cas9技术的烟草NtDXR基因敲除及功能分析[J].烟草科技，2016，49（6）：1 243-1 249.

[10]柴帆.高彩霞：植物基因“剪刀手”[J].中国农村科技，2018（5）：74-76.