Pb2+对果蝇生育力和寿命及抗氧化能力的影响*

叶文斌 何玉鹏 文晓晓 尤旦娃 赵 丽 杨 滟

(1. 陇南师范高等专科学校，农林技术学院，甘肃 成县 742500； 2. 陇南特色农业生物资源研究开发中心，甘肃 成县 742500； 3. 甘肃省农业固体废弃物资源化利用重点实验室，甘肃 天水 741000)

0 引 言

铅是有毒重金属，也是一种广泛存在的环境污染物，污染范围己由职业环境扩大到生活环境，对人体健康造成较大危害[1]，近年来大量研究表明，慢性铅中毒对神经系统、免疫系统、生殖系统、肝、肾、脾等全身各系统和器官均有毒性作用，导致如心肌炎、心脏传导功能障碍、改变心肌细胞膜通透性等疾病也越来越多[2-3]．铅对动物及人群毒理作用常表现为减少精液量，降低精子活力和密度，增加畸形率[4]，血清中睾酮黄体生成素、卵泡刺激素和雌二醇水平波动较大，使内分泌功能紊乱[5-7]，刺激月经周期和经期异常，引起不良妊娠和子代生长发育缺陷[8-9]；铅还能聚积在细胞核内，干扰细胞增殖和DNA的合成，影响DNA复制的精确性而导致染色体丢失[10]．果蝇具有生存期短、繁殖量大、饲养简便和反应灵敏等优点，因其代谢系统、生理功能、性别决定和生长发育等方面同哺乳动物基本相似，故较多地将其应用于衰老或寿命等方面的研究[11-12]，同时果蝇是真核生物，具有与人类相似的生长、发育、繁殖、衰老等阶段．果蝇的应用相当广泛，在药物和功能食品研究中，果蝇常用作延缓衰老实验模型，特别是在遗传生物学和毒理学评价方法中应用较多[13]．

动物体内铅的积累会影响其正常生长、发育、生殖及衰老，甚至会发生病变和死亡．因此，本文以模式动物黑腹果蝇(drosophilamelanogaste)为研究对象，采用生存实验及统计分析方法研究不同浓度铅处理对果蝇的毒理作用，分析探讨铅对果蝇寿命和生育力及抗氧化能力的影响，以期为环境中重金属元素铅对果蝇生长发育影响的研究提供证据．

1 材料与方法

1.1 实验试剂及仪器

恒温生化培养箱 (宁波东南仪有限公司).高温灭菌锅(上海三申医疗器械有限公司).超净工作台(山东博客科学仪器有限公司).电子天平(福州华志科学有限公司).组织匀浆器(上海垒固仪器有限公司).L5紫外可见分光光度计(上海仪电分析仪器有限公司).高速冷冻离心机(北京时代北利离心机有限公司).电炉(上海圣科仪器设备有限公司).超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(批号20160822)、过氧化氢酶(CAT)试剂盒(批号20170509)、MDA试剂盒(批号20170729)均由南京建成生物工程研究所提供．乙醚、乙醇、丙酸、硝酸铅均为分析纯(西安天茂化工有限公司).蔗糖、琼脂、酵母膏[卡迈舒(上海)生物科技有限].玉米粉(购自陇南成县五洲超市).

1.2 研究对象

野生型黑腹果蝇(drosophilamelanogaster)由西北师范大学遗传学实验室提供，培养于温度为25℃，相对湿度为65%的恒温恒湿培养箱．

1.3 实验方法

基本培养基用250 mL蒸馏水，28 g玉米粉，22 g 蔗糖，2.5 g琼脂，2 mL丙酸和2.5 g鲜酵母加热配制[11]．在基本培养基中加入Pb(NO3)2溶液，浓度分别为1.0×10-2、1.0×10-3、1.0×10-4和1.0×10-5g/mL，设基本培养基为对照组．

1.3.1生育力测定

在无菌状态下，每瓶各接种10对未交配的雄果蝇和处女蝇放入上述培养基中，7 d后移去亲本，待出现子一代(F1)果蝇时，按性别分别统计数量和性别比，在观察记载的同时，随机取出10对未交配的F1代雌、雄果蝇重新放入新培养基中作继代培养，繁殖子二代(F2)，F2代再继代培养至子三代(F3)，F3代再继代培养至子四代(F4)，每处理设10个重复，分别统计其数量和性别比[11]．

表1 不同浓度Pb2+对果蝇世代生育力统计只)

注：a与0浓度组相比，t=0.006 5～0.008 1，P<0.01

1.3.2寿命测定

收集未交配的雌、雄果蝇隔离培养，每瓶各接入50只，两种培养基各接10瓶(5♀，5♂)，每天观察，记录死亡个体数，直到最后一只果蝇死亡[11]．对统计的结果进行整理，计算出平均寿命和最高寿命，平均寿命=每组所有果蝇寿命之和÷果蝇总数；最高寿命=每组最后4只果蝇生存时间的总和÷4；从生育力实验中取F2至F4代进行寿命实验，方法同前，以比较其与前者死亡率的差异．

1.3.3果蝇抗氧化活性测定

将培养30 d的果蝇50只，移入含有湿润滤纸的空白管中，用乙醚使其麻醉、称重后放入4 ℃预冷的研钵中，按49 ∶1(μL/mg)的比例加入预冷的生理盐水，充分研磨后，经冷冻离心机3 500 转/min离心15 min，离心半径3cm，取上清液进行抗氧化能力的测定．超氧化物歧化酶(SOD)活力、过氧化氢酶(CAT)活力、丙二醛(MDA)含量及测试液中蛋白质含量均采用对应试剂盒进行测定．所需试剂均严格按照试剂盒说明书配制，测定方法严格遵循试剂说明书的操作进行．

1.4 数据统计与分析

2 结 果

2.1 Pb2+对果蝇生育力的影响

不同浓度Pb2+对果蝇世代生育力、世代生育总量和性别比的统计结果列于表1～3．随着Pb2+浓度的升高，F1至F4代雌、雄果蝇数量均呈现出降低的趋势．在Pb2+浓度为1×10-5g/mL时，雌、雄果蝇数量和果蝇世代总量均低于对照组，与对照组相比存在统计学差异(t=0.006 5，P<0.01)；当Pb2+浓度为1×10-2g/mL时，雌、雄果蝇数量和果蝇世代总量是对照的50%左右；在Pb2+浓度为1×10-5和1×10-4g/mL时，F1至F4代雌、雄果蝇数量的比值变化不大，总体接近于1 ∶1；Pb2+浓度为1×10-3g/mL时，F1至F4代雌、 雄果蝇数量的比值发生了明显的变化，F1至F2代雌、雄果蝇数量的比值变化不大，总体接近于1 ∶1，F3至F4代雌、雄果蝇数量的比值为1.116 ∶1和1.143 ∶1；随着Pb2+浓度升高为1×10-2g/mL时，F3至F4代雌、雄果蝇数量的比值为1.316 ∶1 和1.165 ∶1，果蝇世代总量雌、雄果性别比为1.115 ∶1，结果表明Pb2+对果蝇生育力的影响雄性大于雌性．

表2 不同浓度Pb2+对果蝇世代生育总量统计只)

注：a与0浓度组相比，t=0.007 1～0.008 9，P<0.01

表3 不同浓度Pb2+对果蝇世代性别比统计结果(♀ ∶♂)

表4 不同浓度Pb2+对果蝇不同世代寿命统计

注：a与0浓度组相比，t=0.006 7～0.008 4，P<0.01；b与0浓度组相比，t=0.038 2～0.045 3，P<0.05

表5 不同浓度Pb2+对果蝇累积世代寿命统计

注：a与0浓度组相比，t=0.004 9～0.009 0，P<0.01；b与0浓度组相比，t=0.036 7～0.048 4，P<0.05

2.2 Pb2+对果蝇寿命的影响

不同浓度Pb2+对果蝇世代寿命和累积世代寿命的统计结果列于表4和表5．随着Pb2+浓度的升高，F1至F4代雌、雄果蝇的寿命均呈出降低的趋势．当Pb2+浓度为1.0×10-2g/mL时，与其他组相比，F1至F4代雌、雄果蝇的寿命，雌、雄果蝇的总寿命和雌、雄果蝇的最长寿命都最低，雌、雄果蝇的寿命分别为(41.92±0.16)和(36.88±0.35)d，对照组的寿命分别为(59.59±0.58)和(58.68±0.51)d；雌、雄果蝇的最长寿命分别为(56.68±0.41)和(57.61±0.25)d，对照组的最长寿命分别为(84.39±0.69)和(83.25±0.75)d．Pb2+浓度在1.0×10-3～1.0×10-5g/mL时，F1至F4代雌、雄果蝇的寿命逐渐升高．当Pb2+浓度为1.0×10-5g/mL时，与其他浓度相比，F1至F4代雌、雄果蝇寿命，雌、雄果蝇的总寿命和雌、雄果蝇的最长寿命都最高，但仍低于对照，与对照组相比存在显著性差异(t=0.008 4，P< 0.01)．

表6 不同浓度Pb2+对果蝇超氧化物歧化酶活性的影响结果

注：a与0浓度组相比，t=0.005 2～0.009 2，P<0.01；b与0浓度组相比，t=0.034 1～0.047 6，P<0.05

表7 不同浓度Pb2+对果蝇过氧化物酶活性的影响结果

注：a与0浓度组相比，t=0.006 4～0.008 6，P<0.01；b与0浓度组相比，t=0.046 5～0.048 9，P<0.05

表8 不同浓度Pb2+对果蝇丙二醛含量的影响结果

注：a与0浓度组相比，t=0.005 6～0.007 7，P<0.01；b与0浓度组相比，t=0.041 7～0.047 3，P<0.05

2.3 Pb2+对果蝇抗氧化酶的影响

不同浓度Pb2+对雌、雄果蝇体内SOD、CAT活性和MDA含量的统计结果列于表6～8．随着Pb2+浓度的升高，F1至F4代雌、雄果蝇体内SOD和CAT活性均呈现出降低的趋势．当Pb2+浓度为1.0×10-2g/mL时，与其他浓度相比，F1至F4代雌、雄果蝇体内SOD和CAT活性都最低，与对照相比存在极显著差异(t=0.009 2，P<0.01)．当Pb2+浓度在1.0×10-5～1.0×10-3g/mL时F1至F4代雌、雄果蝇体内的SOD和CAT活性逐渐升高．当Pb2+浓度为1.0×10-5g/mL时，与其他浓度相比，F1至F4代雌、雄果蝇体内的SOD和CAT活性都最高，但仍极显著高于对照(t=0.005 2，P<0.01)．随着Pb2+浓度的升高，F1至F4代雌、雄果蝇体内MDA含量均呈现明显的升高趋势，与果蝇体内SOD和CAT活性呈相反趋势．当Pb2+浓度为1.0×10-2g/mL时，与其他浓度相比，F1至F4代雌、雄果蝇体内MDA含量是最高的，与其他浓度相比存在极显著的差异(t=0.007 3，P<0.01)．当Pb2+浓度为1.0×10-5g/mL时，与其他浓度相比，F1至F4代雌、雄果蝇体内的MDA含量都是最低的，与对照组相比存在极显著的差异(t=0.006 8，P<0.01)，这也说明，随着Pb2+浓度的降低，Pb2+对果蝇的毒害作用在逐渐减弱，果蝇的抗氧化作用也在逐渐增强．在不同Pb2+浓度处理下雌性果蝇体内SOD、CAT活性和MDA含量均低于雄性果蝇体内的含量，这也说明，雄性果蝇的抗氧化作用强于雄性果蝇．

3 讨 论

铅是一种用途广泛的重金属，可经呼吸道、消化道等不同途径进入人体并产生较强的毒性，可影响大脑皮层兴奋与抑制的平衡，以及对周围神经产生直接损伤，也会与巯基蛋白结合并抑制酶的活力和氧化磷酸化，干扰人体的正常代谢，同时还会损害小动脉和毛细血管，导致血管痉挛，将明显增加心血管疾病患者的死亡风险[14-16]．果蝇因为具有生存期短、繁殖快、反应灵敏、培养和管理方便，且代谢途径、生理功能和发育阶段同哺乳动物基本类似等特性常被用作动物模型来研究抗衰老活性及动物抗衰老机制[17]．本研究以果蝇为研究对象，探讨了不同浓度的Pb2+对果蝇生育力和寿命的影响，并以抗氧化酶活性SOD和CAT活以及脂质过氧化酶产物MDA含量为指标评价了的抗氧化活性．结果表明，添加不同Pb2+浓度使F1至F4代雌、雄果蝇世代生育力减弱，寿命降低，当Pb2+浓度达1.0×10-2g/mL时效果最为明显，这时果蝇体内MDA含量大量积累，SOD和CAT活性急剧降低，使果蝇提前衰老、死亡并且降低或丧失生殖能力，F3和F4代雌、雄果蝇数量的比值为1 ∶1.316和1 ∶1.165，果蝇世代总量雌、雄果性别比为1 ∶1.113，这种结果表明Pb2+对果蝇生育力的影响雄性大于雌性． 而在Pb2+浓度较低时(1.0×10-5g/mL)F1至F4代雌、雄果蝇数量的比值变化不大，总体接近于1 ∶1．

果蝇的衰老与体内自由基的水平、抗氧化能力及甲基化水平密切相关，过多的自由基与细胞膜中不饱和脂肪酸发生反应，可破坏DNA及蛋白质等生物大分子的结构，进而导致疾病的产生甚至死亡[18]．铅是一种全身性毒物，机体不同系统和器官对铅的毒性效应的敏感性不同，血液中铅质量浓度超过100 μg/L 时，即可人体智力发育造成严重影响[19]，5×105μg/L铅水平可导致大鼠海马细胞凋亡[20]，Southard等[21]研究发现，血铅质量浓度>331 μg/L 时人体发生肾细胞癌的危险性增加．所以当重金属铅的存在时，对果蝇体内SOD、CAT活力以及MDA含量产生了较为明显的影响，这种胁迫结果已经表明Pb2+与果蝇的衰老之间存在特定的关系，MDA是在高浓度Pb2+处理下，果蝇体内细胞膜多不饱和脂肪酸受自由基作用产生的过氧化脂质的分解产物，当与蛋白质、肽类等大分子聚合后会引起机体的衰老[1-3]，从而影响果蝇的寿命．SOD和CAT都具有一定的抗氧化活性，能够清除生物体内自由基并通过减少脂质过氧化过程而延缓衰老，当Pb2+浓度较高时，MDA含量急剧升高，SOD和CAT的抗氧化活性降到了最低，可能是，大量积累的MDA刺激果蝇主动启动SOD和CAT清除体内产生的自由基而消耗了两者的量，来主动增强果蝇的抗性，同时间接促进生育能力．影响果蝇的生育力的因素是多方面的，也是一个非常复杂的研究课题，而Pb2+是如何在分子水平参与生殖破坏的，还需进一步研究与探索．