C反应蛋白对巨噬细胞分泌趋化因子CXCL16影响的研究

陈静文 王审 林冬铭 黄抒伟

冠心病的发病机制一直是研究热点。近年新发现的CXC趋化因子配体16（CXCL16）既具有趋化因子的功能，同时还可作为清道夫受体吞噬氧化的低密度脂蛋白，促进泡沫细胞形成[1］，此外CXCL16还有促进平滑肌细胞、内皮细胞增殖，增加细胞与细胞间黏附，刺激血管生成的作用[2］。C反应蛋白（CRP）是一个最强的独立于血脂预测作用的心血管疾病预测因子。CRP参与急性冠脉综合征形成和进展的各个阶段，包括内皮功能异常、内皮活化、斑块形成及斑块破裂等[3］。Han等[4］体外实验研究发现，重组人CRP可上调单核细胞中CC趋化因子受体2的表达，促进由单核细胞趋化因子-1介导的对单核细胞的趋化作用。而同为趋化因子家族成员的CXCL16，是否与CRP存在某些联系？目前国内外较少这方面的研究，本文通过体外培养THP-1细胞，在药物诱导下转化为巨噬细胞，检测在CRP干预下巨噬细胞分泌CXCL16水平的变化情况，探讨这两种炎性标志物之间的关系，现将研究结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂 人单核细胞白血病细胞系THP-1细胞由中科院上海细胞所提供；主要试剂:重组人CRP（德国Merck公司）；CXCL16ELISA试剂盒（美国R＆D公司）；FBS（杭州四季青公司）；佛波醇（美国sigma公司）；改良型RPMI1640培养基（美国GIBCO公司）；总RNA提取剂TRIZOL Reagent（美国invitrogen公司）；逆转录试剂盒（加拿大Fermentas公司）；CXCL16引物及内参（由上海生工公司设计）。CXCL16引物:上游引物5’-ACTCAGCCA GGCAATGGCAAC-3’；下游引物 5’-GGTATTAGAG TCAGGTGCCAC-3’；扩增片段长度为693bp。扩增内参照磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）基因:上游引物 :5’-GGTCGGAGTCAACGGATTTG-3’； 下 游 引物:5’-ATGAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3’；扩增片段长度:350bp。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及诱导 将THP-1细胞与10ml含有10%FBS的RPMI1640培养液加至培养瓶中，置于5%CO2、37℃温箱中，饱和湿度下常规培养，待培养液发黄后1～2d传代，当培养瓶中细胞培养至活细胞数达5×106个/ml时，将细胞接种于6孔培养板中，共接种25个孔，每孔接种3ml细胞液，给予佛波醇（60ng/ml）处理24～48h，在倒置显微镜下观察细胞呈现形状不规则且贴壁生长，即为诱导成功[5］，开始计时。

1.2.2 ELISA法检测CXCL16水平 无菌管收集5个时间点（6、12、24、48、72h）巨噬细胞培养液，离心后取上清液置于-80℃冰箱中备用。采用ELISA法检测5个时间点细胞上清液CXCL16水平。

1.2.3 CRP干预实验 （1）将诱导成功的巨噬细胞分为 5 组，分别加入 0、5、10、20、50μg/ml CRP 至培养孔共同孵育。至巨噬细胞分泌CXCL16水平最高的时间点时收集上清液，采用ELISA法检测CXCL16水平。（2）RT-PCR:提取5组巨噬细胞RNA，各管取5μlRNA放入EP管中，70℃水浴箱中孵育10min，进行基因扩增，反应条件为25℃5min、42℃60min、70℃ 5min、99℃ 10min。取逆转录产物 2μl置于 EP 管中，顺序加入:氯化镁（1.5μl）、10×反应液（2.5μl）、无核酸酶水（16.75μl）、三磷酸脱氧核苷酸混合溶液（0.5μl）、上游引物（0.75μl）、下游引物（0.75μl）、DNA 聚合酶（0.25μl）。设置 PCR 反应条件为:94℃3min预变性，94℃30s变性，58℃30s退火，72℃45s延伸，34个循环，72℃继续延伸10min。PCR反应结束后，取5μl扩增产物与1μl 6×反应液混合后用10g/L的琼脂糖凝胶恒压100V电泳30min，利用紫外分析仪对电泳结果进行观察并拍照。对PCR电泳结果进行灰度值扫描并半定量分析。计算5组CXCL16与相应的内参GAPDH基因PCR产物的灰度值之比，比较5组CXCL16基因mRNA的相对表达水平。

1.3 统计学处理 采用SPSS17.0统计软件，计量资料以表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 THP-1诱导为巨噬细胞后不同时间点分泌CXCL16水平情况 见图1。

图1 THP-1诱导为巨噬细胞后不同时间点分泌CXCL16水平情况

由图 1 可见，6、12、24、48、72h 分泌 CXCL16 水平分别为:（52.911±6.802）、（168.635±13.051）、（506.597±18.853）、（325.459±13.850）、（166.979±12.358）ng/L。12h与72h比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；其余时间点两两比较，差异均有统计学意义（均P＜0.01）。5个时间点中，24h为CXCL16分泌水平高峰。

2.2 5组巨噬细胞分泌CXCL16水平比较 见图2。

由图2可见，5组巨噬细胞分泌CXCL16水平分别为:（518.363±12.438）、（641.161±13.438）、（825.002±15.186）、（1129.026±16.853）、（1611.443±19.962）ng/ml。组间两两比较，差异均有统计学意义（均P＜0.01）。

2.3 5组巨噬细胞CXCL16基因RT-PCR电泳结果及mRNA的相对表达水平比较 见图3。

图2 5组巨噬细胞分泌CXCL16水平比较

图3 5组巨噬细胞与不同浓度CRP共同孵育后，CXCL16基因、内参GAPDH基因RT-PCR电泳结果及mRNA的相对表达水平比较（A:CXCL16基因PCR电泳照片；B:内参GAPDH基因PCR电泳照片；C:5组CXCL16与内参GAPDH基因PCR产物灰度值之比）。

由图 3可见，5组 CXCL16与 GAPDH基因PCR产物灰度值之比分别为:0.120±0.011、0.230±0.015、0.502±0.021、0.808±0.015、1.082±0.008，组间两两比较，差异均有统计学意义（均P＜0.01）。随着CRP干预剂量的增加，巨噬细胞分泌CXCL16的水平和CXCL16mRNA的表达呈剂量依赖性增加。

3 讨论

动脉粥样硬化不仅是简单的脂质堆积，其中涉及到内皮功能、炎症因子以及多种血液因素之间的相关作用，炎症反应贯穿于粥样硬化斑块的形成、演变以及破裂的整个病理过程[6］。炎症细胞与血管内环境中的细胞、细胞因子、炎症介质等的相互作用极其复杂，而趋化因子则是联系炎症与动脉粥样硬化发生的枢纽。CXCL16作为与动脉粥样硬化相关的重要炎症因子，目前的临床研究很多， Ma等[7］对227例急性缺血性卒中患者临床研究发现，血清CXCL16水平与发生动脉粥样硬化性脑卒中密切相关。Lehrke等[8］检测了464例冠心病患者及235例正常人的血清CXCL16水平，结果也显示冠心病患者CXCL16水平明显高于正常人，尤其是急性冠脉综合征患者。目前国内外关于CXCL16与动脉粥样硬化相关的多种炎症因子关系的研究甚少，许多作用机制和途径仍有待进一步研究证实。

本实验之所以选择THP-1细胞来进行研究，是由于该种细胞培养技术已成熟，且诱导为巨噬细胞的条件可靠，简单易行。而选择了CRP作为干预因素，是因为它是冠心病的发病机制中具有重要地位的一种急性期蛋白。尽管最初认为CRP仅仅作为血管炎症的一个标志物在动脉粥样硬化斑块的形成中发挥作用，但最近的研究已证明:它还可以起到更为主动的作用。它可以直接参与到病变的形成、斑块的破裂以及血栓的生成中，可以促进单核细胞的聚集、浸润到血管壁内，并发展为泡沫细胞，在动脉粥样硬化斑块部位可以发现有CRP沉积在血管壁上。Minako等[9］研究发现将一定浓度的CRP与人血管内皮细胞孵育后可刺激IL-18的分泌，提示冠心病患者循环血中的CRP可能通过上调IL-18而产生一系列炎症反应，而目前认为IL-18又可上调CXCL16的分泌，这就将CRP与CXCL16相联系起来。大规模的人群调查发现稳定性心绞痛患者血清CRP浓度≥5μg/ml，而急性冠脉综合征患者则≥10μg/ml[10］。因而实验组选择了 5、10、20、50μg/ml作为 CRP 的干预剂量。实验结果经统计学分析后发现随着加入CRP剂量的增加，巨噬细胞分泌CXCL16的水平及CXCL16mRNA表达也上调。基于体外细胞培养水平，此次研究阐明了CRP与CXCL16之间存在相关性:CRP可作用于巨噬细胞，刺激CXCL16的表达，提示在动脉粥样硬化发病过程中，这两种具有代表性的重要炎症因子之间存在着相互作用。

虽然目前CRP和CXCL16之间具体作用机制尚不清楚，但已经有一些相关的实验室研究提供了方向和思路。在一项关于心血管疾病与慢性阻塞性肺病相关的炎症反应发生机制的关系研究中发现，吸烟可通过增强血管内皮细胞Nox5的表达、RhoA/p38 MAPK/NF-κB信号通路激活从而上调CXCL16的表达[11］。在临床上，我们发现部分动脉粥样硬化患者尽管接受了严格生活方式指导以及最优化的药物治疗，内环境中的炎症及免疫反应仍然持续存在，导致疾病反复甚至进展[12］。Ridker等[13］报道了CANTOS研究的初步结果，所有入选患者均诊断“急性心肌梗死”并且伴有超敏CRP升高，随机分为两组，分别及接受Canakinumab（人白细胞介素-1β的单克隆抗体，目前已被批准应用于临床风湿疾病的治疗）及安慰剂治疗3个月。与安慰剂组比较，Canakinumab组超敏CRP明显降低，且呈剂量依赖性，同时并不降低外周血的LDL-C水平。3个月后Canakinumab组一级终点事件（非致死性心肌梗死、非致死性卒中、心血管死亡）发生率更低。CANTOS研究更进一步证实了冠心病的炎症假说。在信号通路方面，Wenlin等[14］发现他汀在冠心病患者治疗过程中通过抑制IL-1β和NF-κB信号通路来发挥其抗炎作用。在本实验研究基础上还可以继续探讨CRP影响CXCL16表达的作用途径并可实施药物干预实验，为动脉粥样硬化性心血管疾病的治疗提供新的思路及靶点。