阿托伐他汀经LOX-p38-MMP-2信号轴逆转糖尿病心肌病大鼠心肌组织纤维化的研究

王纪人 刘会 杨帆

糖尿病发生后，高糖毒性及胰岛素抵抗等因素可诱导多种细胞因子过度表达，引起成纤维细胞增生和胶原纤维沉积，最终引起心肌细胞肥大及细胞外基质重塑及心功能衰竭，形成糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）。赖氨酰氧化酶（lysyl oxidase，LOX）使胶原纤维及弹性纤维稳定[1］，LOX 表达过多可导致组织纤维化[2］。既往我们的研究也证实，LOX参与慢性心力衰竭小鼠心肌组织的重塑，阿托伐他汀可逆转这一现象[3］。目前的研究多涉及LOX参与心脏重塑，但LOX逆转糖尿病心肌病大鼠心肌组织纤维化与LOX-p38-基质金属蛋白酶-2（MMP-2）信号轴的相关性尚未涉及。本实验拟通过观察阿托伐他汀逆转糖尿病心肌病大鼠心肌组织纤维化与LOX-p38-MMP-2信号轴的关系，为临床应用他汀类药物抑制心室重塑提供一定的理论基础，现将研究结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 试验动物与分组 选取8周、52～58g、SPF级健康雄性SD大鼠40只 [合格证编号:SCXK-（渝）2012-0005］，应用随机数字表法分为3组:DCM组15只；治疗组15只；对照组10只。所有动物置于动物房内予颗粒饲料 [许可证号:SCXK-（粤）2008-0002］饲养，自由饮水。

1.2 方法

1.2.1 造模方法 脲佐菌素（streptozotocin，STZ）溶解于pH 4.5的0.1mmol/L枸橼酸缓冲溶液中，DCM组及治疗组大鼠腹腔注射STZ 65mg/kg[4］，72h后，测定大鼠尾静脉血糖，≥16.7mmol/L则认为糖尿病动物模型造模成功，期间DCM组及治疗组各死亡3只（20%）。注射链脲佐菌素72h后，治疗组予阿托伐他汀2mg·kg-1·d-1灌胃，DCM组予以等量0.9%氯化钠注射液灌胃。对照组正常饮食，自由饮水。

1.2.2 超声心动图检测 试验8周末，腹腔注射7%水合氯醛（0.5ml/100g）麻醉所有大鼠，采用VisualSonics Vevo770超声心动图仪（探头17.5MHz）测量各大鼠心脏超声参数，包括左心室舒张末期内径（LVEDd）、左心室收缩末期内径（LVESd），并计算左心室射血分数（LVEF）和左心室短轴缩短率（LVFS）。

1.2.3 左心室质量指数（LVMI）测定 试验8周末，麻醉下开胸取出完整的心脏，除去心外膜，沿着房室隔除去右心室、左心房和右心房，并保留室间隔。冷肝素盐水用于清洁心腔中的残余血液。滤纸吸干水份并称取左心室质量，计算LVMI。LVMI=LVM（mg）/体质量（g）。其后切取部分心肌置于4%多聚甲醛中固定，用于HE及Masson染色；其余心肌冻存于液氮中用于检测RNA和蛋白质。

1.2.4 心肌纤维化面积测定 采用HE、Masson染色方法，经过多余甲醛固定的心肌组织予脱水、常规石蜡包埋、切片、常规脱蜡至水。HE染色:苏木素漂染5min，1%盐酸酒精分化洗涤5s，梯度酒精脱水各10min，伊红漂染5s，树胶封片。Masson染色:苏木素漂染5min，蒸馏水漂洗5min，磷钼酸分化，苯氨蓝漂染2min，二甲苯透明后树胶封固。组织切片置于Leica光学显微镜下进行拍照并分析，参照文献[5］测定心肌纤维化（myocardial fibrosis，MIFI）面积。

1.2.5 RNA相对表达量测定 采用实时荧光定量PCR法，按照试剂盒说明术提取液氮中冻存的心肌组织总RNA，并计算总RNA纯度。采用Icyclery IQ real-time PCR仪按照试剂盒说明书操作测定LOX和MMP-2 mRNA表达水平。所有引物均由大连晨钰生物有限公司合成，序列由Genebank提供，β肌动蛋白（β-actin）上游引物:5’-TTGTTCCTACTTAT GGAATCCT-3’，下游引物:5’-GTTCGGCATCATGC TGCCTA-3’，扩增片段为 354bp；LOX 上游引物：5’-ACGCTTGTTCGCTCAGTAGAG-3’，下游引物:5’-A GCTCCGTTCTCGCTTCTAGC-3’，扩增片段为148bp；MMP-2 上游引物:5’-ACGCGTGCTTACTGATGAGAG-3’，下游引物:5’-ACTTGCTATCTGGTATGCAGC-3’，扩增片段为246bp。反应条件为:预变性95℃×10min，变性 95℃×10s，退火 /延伸 60℃×45s，循环 37 次。

1.2.6 蛋白相对表达量测定 采用Western blot法检，按照试剂盒说明书提取液氮中冻存的心肌组织全蛋白测定蛋白浓度。取50μg全蛋白进行8%SDS-PAGE电泳分离蛋白后并进行转膜，15%牛奶-PBST溶液室温下封闭60min，室温下加入一抗，抗体与膜充分结合后置于4℃冰箱过夜（β-actin:鼠抗单克隆抗体，1∶2 000；p38:鼠抗单克隆抗体，1∶500；磷酸化 p38:鼠抗单克隆抗体，1∶500；MMP-2:鼠抗单克隆抗体，1：500），第2天室温下PBS洗涤10min×5次，加入HRP标记的二级抗体（β-actin:羊抗小鼠，1∶20 000；p38:兔抗鼠，1∶2 000；磷酸化p38:兔抗鼠，1∶2 000；MMP-2:兔抗鼠，1∶500）结合 60min，PBST漂洗 10min×5次，ECL法发光显像，X线压片曝光并扫描，用Imag系统对条带进行灰度分析，计算目标蛋白的相对含量。

1.3 统计学处理 采用SPSS18.0统计软件，符合正态分布的计量资料以表示，组间比较采用单因素方差分析，相关性分析采用Pearson法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组大鼠一般情况比较 对照组10只大鼠无一只死亡；DCM组大鼠存活6只（40.0%）；治疗组存活8只（53.3%）。DCM组及治疗组大鼠精神及活动量均较对照组稍差。

2.2 3组大鼠超声心动图指标比较 见表1。

表1 3组大鼠超声心动图指标比较

由表1可见，3组大鼠4项超声心动图指标比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。DCM组、治疗组LVEDd和 LVESd均高于对照组，LVEF及LVFS均低于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。治疗组LVEDd和LVESd低于对照组，LVEF及LVFS高于DCM组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

2.3 3组大鼠LVMI及MIFI比较 见表2。

由表2可见，DCM组大鼠LVMI、MIFI均高于对照组；治疗组大鼠LVMI和MIFI较DCM组低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

表2 3组大鼠LVMI及MIFI比较

2.4 3组大鼠心肌组织HE及Maason染色 见图1-2。

图1 3组大鼠左心室心肌组织HE染色（A:DCM组；B:治疗组；C:对照组；×400）

图2 3组大鼠左心室心肌组织Masson染色（A:DCM组；B:治疗组；C:对照组；×400）

由图1-2可见，HE染色显示，对照组大鼠心肌组织排列整齐，未见水肿及核破裂；DCM组大鼠则出现心肌细胞明显水肿及排列紊乱，可见部分心肌纤维断裂及核破裂；治疗组大鼠心肌损害较DCM组有所减轻。Masson染色显示，对照组心肌胶原纤维正常，未见纤维化现象；DCM组大鼠心肌组织胶原纤维明显增多、纤维化明显，治疗组大鼠心肌组织胶原纤维较DCM组明显减少，纤维化有所减轻。

2.5 3组大鼠左心室心肌组织LOX和MMP-2 mRNA的表达水平比较 见表3。

由表3可见，DCM组大鼠心肌组织LOX和MMP-2 mRNA表达较对照组明显增加。与DCM组比较，治疗组大鼠心肌组织LOX和MMP-2 mRNA表达较低，差异均有统计学意义（均P＜0.01）。

表3 3组大鼠左心室心肌组织LOX和MMP-2 mRNA的表达水平比较

2.6 3组大鼠左心室心肌组织LOX、MMP-2、p38和磷酸化p38蛋白表达水平的比较 见表4，图3。

表4 3组大鼠左心室心肌组织LOX、MMP-2、p38和磷酸化p38蛋白表达水平的比较

图3 3组大鼠左心室心肌组织LOX、MMP-2、p38和磷酸化p38蛋白表达（1:对照组；2:DCM组；3:治疗组）

由表 4可见，DCM组大鼠心肌组织 LOX、MMP-2和磷酸化p38表达较对照组明显增加，治疗组大鼠心肌组织LOX、MMP-2和磷酸化p38表达较DCM组明显下调，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。3组大鼠心肌组织p38表达比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

2.7 大鼠左心室心肌组织LOX、MMP-2和磷酸化p38与心肌重构指标的关系 DCM组大鼠左心室心肌组织MIFI与LOX、MMP-2和磷酸化p38均呈正相关（r=0.74、0.71、0.64，均P＜0.05）。

3 讨论

糖尿病现已成为威胁人类健康的隐形杀手，其发病率居高不下，DCM是糖尿病晚期最常见的并发症之一，在糖尿病病程中，高糖毒性损伤心肌细胞及细胞外基质，可引起心肌细胞肥大及细胞外基质增生，引起心功能不全[6］。我们的研究结果表明，糖尿病心肌病大鼠左心室扩大、LVEF及LVFS下降、心肌组织明显纤维化，而应用阿托伐他汀治疗后大鼠心功能有所好转，心肌组织纤维化明显有所减轻。

LOX在维持组织性能学稳定方面发挥重要的作用，只有适量的LOX表达才能维持组织的正常功能，LOX表达与组织纤维化程度呈正相关[1，7］。有研究研究表明，对慢性心力衰竭心肌组织进行HE染色及测定心肌组织LOX mRNA及蛋白发现，LOX过度表达与心肌纤维化呈正相关，抑制LOX表达后，心肌纤维化明显减轻[8］。在扩张型心肌病患者心肌组织中，LOX及TGF-β表达均明显升高，且TGF-β通过上调LOX表达，促使Ⅲ型胶原纤维蛋白的合成及激活MMP活性增加，而且LOX表达上调与心肌纤维化相关[9］。Xiao等[10］研究发现，心肌梗死的猕猴心肌组织中LOX表达明显升高，且LOX升高与心肌纤维化程度相关。此外还有研究发现，结扎冠状动脉前降支的心肌梗死大鼠，检测心肌组织LOX蛋白发现，心肌梗死大鼠心肌组织LOX表达明显升高，并与心肌纤维化程度呈正相关[11］。此外，制作主动脉左心室瘘引起的心力衰竭动物模型，提取其心肌组织RNA及蛋白，发现心肌组织LOX mRNA及蛋白表达均明显升高，且与心肌细胞凋亡程度有关[12］。以上研究均表明，LOX在心肌纤维化中扮演重要角色。我们的研究表明，DCM组大鼠心肌纤维化明显，心肌组织LOX显著升高，与之前文献描述的研究结果一致，提示LOX在糖尿病心肌病整个疾病的进展中发挥一定的作用。由此我们推测，下调LOX在糖尿病心肌病中的表达可能对治疗糖尿病心肌病起到一定的作用。

他汀类药物具有调脂外的多效性，目前有研究证实，阿托伐他汀可通过调节心肌组织金属蛋白酶的表达来显著缓解冠心病动物模型的心肌纤维化[13］。既往我们有研究表明，阿托伐他汀可通过调节LOX-p38-MMP-9信号轴对慢性心力衰竭小鼠的心肌组织发挥保护作用[3］。本试验研究发现，DCM组大鼠心肌纤维化明显、心功能明显下降，心肌组织LOX、MMP-2 mRNA和LOX、磷酸化p38及MMP-2蛋白表达明显上调；相关分析发现，其心肌纤维化程度与LOX、MMP-2和磷酸化p38表达呈正相关。故我们推测，DCM大鼠左心室心肌纤维化可能与LOX-p38-MMP-2信号轴反应增强有关。应用阿托伐他汀干预DCM大鼠后，心肌组织LOX、MMP-2 mRNA和LOX、磷酸化p38及MMP-2蛋白表达。故我们推测，阿托伐他汀可通过LOX-p38-MMP-2信号轴减轻糖尿病心肌病大鼠心肌组织纤维化。而各组P38表达无明显变化，分析阿托伐他汀对大鼠的心肌纤维化保护作用及MMP-2的表达可能是通过磷酸化的p38来实现的。

综上所述，阿托伐他汀可通过LOX-p38-MMP-2信号轴减轻糖尿病心肌病大鼠心肌组织纤维化。