miR-21和miR-135对前列腺癌筛查的临床价值

王威 孙克

世界范围内，前列腺癌(prostate cancer，PCa)是最常见的恶性肿瘤之一，在一些欧美国家甚至常年高居男性恶性肿瘤发病率第一位[1]。近年来，由于人口老龄化的加剧、生活习性的变化和饮食结构的改变等因素，我国PCa的发病率也呈现出显著的上升趋势[2-3]。相较欧美国家，虽然我国PCa的发病率较低，但PCa患者的分期构成却远不及欧美发达国家，且差别巨大。美国确诊的新发PCa病例中临床局限型PCa所占比例接近81.0%，其一线治疗为根治性手术或根治性放疗，通常预后良好，5年生存率高达90.0%[4]。我国确诊的新发PCa病例中临床局限型患者的比例仅为30.0%，意味着约70.0%的PCa患者为局部晚期或已发生广泛转移，这部分患者无法接受局部根治性治疗，且预后较差[5]。因此，更加早期的确诊和及时治疗是改善我国PCa患者预后的重要手段与有效途径。如何在一般人群中筛查出事实上已患癌症的患者是摆在我们面前的首要问题。研究证实，细胞在肿瘤发生、发展及转移过程中会释放肿瘤内源性miRNA进入外周循环，与体内靶基因mRNA3’结合，诱导miRNA靶基因降解，因此理论上外周血游离miRNA能够用于肿瘤的诊断与预后[6-7]。miR-21和miR-135均具有调控PCa细胞增殖的作用，本研究采用实时荧光定量PCR法检测PCa患者血清中miR-21和miR-135的表达水平，分析其与PCa的相关性，以期为PCa的诊断与预后提供新的参考指标。现报告如下。

对象与方法

一、一般资料

选取2016年8月至2018年6月我院收治并经病理活检确诊的PCa患者、良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia,BPH)患者和同时期体检正常的健康人群各80例，分别纳入PCa组、BPH组和健康组。PCa组、BPH组和健康组平均年龄分别为(58.23±5.42)、(57.51±5.21)和(56.83±6.03)岁，3组的年龄差异无统计学意义，具有可比性(P>0.05)。所有受试者均排除糖尿病、心脑血管疾病、其他恶性肿瘤、精神疾病及肝肾功能不全等有可能影响研究均衡性的疾病。本研究经院伦理委员会审核通过，受试者自愿签署知情同意书。

二、研究方法

1.病理分级：依据WHO根据腺体分化程度于2003年制定的Gleason评分标准[8]：评分2～4分代表腺体形态完好的高分化腺癌；评分5～7分代表腺体伴有少量发育不全或融合成筛状的中分化腺癌；评分8～10分代表发育不全，融合成筛状腺体或腺体结构缺乏，并伴坏死的低分化或未分化腺癌。根据PCa临床病理统计分析资料，本研究认为Gleason评分>7分意味着癌肿分化程度差，并伴有浸润性生长和坏死，且存在明显染色变化。

2.RNA提取：采用mirVanaTMPARISTMmiRNA试剂盒(上海嵘崴达实业有限公司生产)对保存在-80 ℃的血清标本进行RNA提取和浓度测定。

3.实时荧光定量PCR测定：提取的1 μg总RNA根据逆转录试剂盒操作说明反转录为cDNA，运用实时荧光定量PCR仪对miR-21和miR-135基因的表达进行定量。miR-21基因的PCR反应条件设置为95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s；55 ℃ 30 s；72 ℃ 20 s。miR-135基因的PCR反应条件设置为95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min。以上操作均在ABI7500实时定量PCR仪上完成，所有反应均重复3次[9]，然后进行相对定量表达水平的计算。

三、统计学方法

结 果

一、各组血清miR-21和miR-135的表达水平比较

PCa组miR-21和miR-135的表达水平均明显高于BPH组和健康组，差异具有统计学意义(P<0.05)；BPH组和健康组间miR-21和miR-135的表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 三组血清miR-21和miR-135表达水平比较

与PCa组比较aP<0.05；与BPH组比较bP>0.05

二、PCa组miR-21和miR-135表达水平与病理分级的相关性

依据PCa病理分级将PCa组分为Gleason评分>7分组和≤7分组，结果显示Gleason评分>7分的PCa患者血清miR-21和miR-135表达水平明显高于Gleason评分≤7分的患者，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 PCa组miR-21和miR-135表达水平与病理分级的相关性

讨 论

我国PCa发病率在近20年间增长超过10倍；从当前中国老龄化和饮食发展趋势来看，其发病率还将继续上升[10]。2015年中国肿瘤年报报道，我国男性发病率升高的6种癌症中就包括PCa，其已经上升至男性恶性肿瘤的第6位[11]。PCa的发病原因尚未完全明确，其与内分泌因子关系复杂，且与患者的生活方式息息相关[12]。借鉴欧美国家PCa的筛查经验，结合我国PCa的诊疗现状，中国抗癌协会泌尿男生殖肿瘤专业委员会前列腺癌学组的二十余位专家于2017年5月对前列腺癌筛查相关问题达成共识[3]，致力于改善我国初诊PCa患者分期偏晚期和PCa患者预后较差的临床现状。

特异度和敏感度相对较高且方便、廉价的检查手段是适用于任何疾病包括肿瘤筛查的先决条件，PCa筛查也不例外。PCa发病隐匿，早期确诊、尽早治疗显得尤为重要。目前临床上最为常用的PCa诊断方法主要包括直肠指检、血清PSA检查和盆腔MRI。经济、安全的直肠指检既往被诸多指南和共识推荐为PCa的筛查手段，但其存在PCa早期诊断价值低、筛查试验敏感度不理想、受医师个人经验和主观因素影响大等缺点。单凭直肠指检筛查只能发现2.0%左右的PCa患者，且发现的患者中48.0%～85.0%已发生前列腺外侵犯，丧失了早期诊治的意义[13]。目前血清PSA虽然是PCa诊断的重要标志物，但是否将其作为PCa筛查的常规手段，学术界一直存在着巨大的分歧。由于PSA是组织特异性抗原而非肿瘤特异性抗原，所以恶性肿瘤、BPH、前列腺炎、前列腺梗死、射精、直肠指检和尿路感染等诸多因素都可导致其异常升高，因此血清PSA检查对PCa诊断的特异性并不理想。MRI检查耗时较长、费用高昂、检查不便利，仅适用于发现异常而需要进一步进行诊断性检查的人群。

近年来分子生物学技术取得了长足的发展，miRNA在恶性肿瘤发生、发展过程中的作用逐渐被大家认知[14]。人体内的miRNA为长度仅22 nt的内源性表达的微小单链RNA，其对基因表达的调节发生在转录后水平，在细胞增殖与凋亡中的作用举足轻重[15]。miRNA能够通过结合体内靶基因mRNA3’端非翻译区(3′-UTR)，从而抑制miRNA靶基因翻译，诱导其降解，因此miRNA靶基因在机体中具有促癌或抑癌的功能[16]。

PCa患者肿瘤细胞的变异增殖需要激活促癌基因，miRNA促癌功能的发挥导致癌细胞增殖增加而凋亡减少，促进恶性肿瘤的进一步发展[17]。本研究中miR-21和miR-135在PCa患者、BPH患者和健康人群的血清中的表达水平呈现出明显的不同，两项指标在PCa组的表达均显著高于BPH组和健康组(P<0.05)，但BPH组和健康组的差异并不具有统计学意义(P>0.05)，这说明miR-21和miR-135检测不仅可以对PCa进行筛查，而且可以对PCa和BPH进行初步鉴别诊断。相较于Gleason评分≤7分的PCa患者，Gleason评分>7分的患者血清中miR-21和miR-135的表达水平也有显著增高，进一步说明这两项指标对评估PCa患者的预后具有参考意义。

综上所述，我们认为miR-21和miR-135在PCa患者血清中呈高表达，可作为PCa筛查、辅助诊断和预后评估的分子标志物。