海水暂养过程中缢蛏挥发性成分变化

冉 云，张思嘉，陈 蓉，冉照收，徐继林*，廖 凯

（宁波大学海洋学院，浙江 宁波 315211）

缢蛏（Sinonovacula constricta）是我国重要的经济贝类，有着悠久的养殖和食用历史，味道鲜美，蛋白质和钙、铁、锌、硒等含量丰富[1]，已成为东南沿海的主要海水贝类养殖品种。贝类净化是指将滤食性的双壳贝类放置在干净的水环境中去除泥沙、细菌和致病微生物的过程，缢蛏作为滩涂贝类的典型代表，其习性为底栖洞穴生活，捕捞后的缢蛏需要通过暂养净化。贝类净化的方法主要有净水区暂养和工厂净化2种方式，其中工厂净化过程中常用的海水消毒杀菌系统有紫外线、氧和臭氧，但暂养是目前消除化学物质污染的唯一方法。现在已有较多暂养净化方式的研究，比如在暂养水体中添加二氧化氯或微藻活体等[2-3]，实际生活中一般家庭大多直接放在海水中暂养，而有关暂养时间对缢蛏风味的研究还很少见。本实验通过固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术，分析在普通海水中暂养净化后的缢蛏不同部位风味物质随时间的变化情况，以期为缢蛏的合理净化时间选择提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新捕捞的带泥缢蛏购于宁波市路林市场，挑选长（7.11±0.18）cm、宽（2.37±0.05）cm的缢蛏，置于温度26 ℃、盐度25%的海水中，避光暂养8、24 h后联同未暂养的缢蛏，分别取18 只样品按照暂养时间在取样后及时用于风味物质测定，暂养期间不换水。

2,4,6-三甲基吡啶（2,4,6-trimethylpyridine，TMP）、C7～C40正构烷烃混标标准品 上海安谱实验科技有限公司。

1.2 仪器与设备

7890B-7000C气相色谱-三重四极杆质谱联用仪美国安捷伦仪器公司；顶空固相微萃取自动进样装置德国Gerstel公司；VOCOL色谱柱（60 m×0.32 mm，0.18 μm）、50/30 μm二乙烯苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）自动固相微萃取头 美国Supelco公司；T10匀浆机 德国IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

把缢蛏泥垢洗净后在自然状态下用吸水纸除去表面水分，将样品分为3 组，分别为消化腺、肌肉及整体，每组3 个平行，添加内标后用匀浆机将各组分别混合均匀，备用。

1.3.2 顶空固相微萃取条件

取4 g处理好的样品放入20 mL顶空瓶中，旋紧盖，通过顶空固相微萃取自动进样装置，用老化好的DVB/CAR/PDMS萃取头于80 ℃萃取30 min后，在250 ℃解吸7 min后进样分析。

1.3.3 气相色谱条件

VOCOL色谱柱（60 m×0.32 mm， 0.18 μm）；升温程序：柱起始温度35 ℃，保持2 min，再以15 ℃/min升至125 ℃，保持1 min，再以2 ℃/min升至200 ℃，保持12 min；载气（He）流速1.6 mL/min；采用不分流进样模式。

1.3.4 质谱条件

电子电离源；电子能量70 eV；离子源温度230 ℃；传输线温度220 ℃；质量扫描范围m/z 40～500；溶剂延迟时间2 min。

1.4 数据处理与分析

定性方法：将测得的各挥发物谱图与计算机谱库（NIST/Wiley）中的标准物质谱图进行对比，辅助以人工图谱解析，并结合正构烷烃标准品的保留时间进行定性分析。

半定量方法[4]：将内标物TMP用甲醇稀释后添加到处理好的缢蛏样品中，用量为1 g样品加入0.03 μg TMP。然后通过色谱图中待测物与TMP的峰面积比值计算其含量。

数据处理及多元统计分析方法：采用SIMCA软件对数据进行主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘法判别分析（partial least squaresdiscrimination analysis，PLS-DA）。

2 结果与分析

2.1 风味物质分析

如表1所示，缢蛏中共鉴定出128 种挥发性风味成分。其中包括醛类（33 种）、酮类（12 种）、醇类（10 种）、芳香类（17 种）、烃类（16 种）、酯类（22 种）、呋喃类（5 种）以及其他化合物（13 种）。

2.2 缢蛏不同组织挥发性组成总体差异性分析

图1 缢蛏不同部位挥发性化合物PCA得分图Fig. 1 PCA score plot for volatile components in different parts of S. constricta

表1 缢蛏不同组分的挥发性成分Table 1 Volatile compounds in different edible parts of S. constricta

续表1

为考察不同组织挥发性组成之间的总体差异性，根据各样品挥发性组成进行PCA，由图1可知，95%的置信区域内，缢蛏样品得到明显区分。从不同部位上来看，缢蛏肌肉集中在PC1的负方向，缢蛏消化腺集中在第1象限，缢蛏整体集中于第4象限，说明缢蛏不同部位的挥发性成分总体存在明显差异。从同一组织不同暂养时间来看，不同时间组的缢蛏肌肉样本聚集紧密，说明在24 h暂养时间内，缢蛏肌肉挥发性成分无明显改变；而不同时间组的缢蛏整体样本和缢蛏消化腺样本均有明显差异，说明在暂养过程中，缢蛏整体和消化腺挥发性成分有较显著变化。缢蛏整体样品（F0、F8、F24）随着暂养时间的延长，由第4象限逐渐向原点靠近，并与缢蛏肌肉（M0、M8、M24）所在区域的距离逐渐缩短；而缢蛏消化腺（S0、S8、S24）中，暂养8 h（S8）与24 h样品（S24）相较于0 h对照组（S0），同样有向缢蛏肌肉所在区域靠近的趋势。

2.3 暂养时间对不同组织挥发性组成的影响

为更好地解释图1中各样品的变化趋势，同时更直观地说明缢蛏各部分随暂养时间的风味变化情况，首先对样本中包含的挥发性物质按官能团进行分类，并通过查阅相关文献[5-7]确定具有特征性气味的挥发性组分并编号（表1），建立X数据集（特征挥发性组分）与Y数据集（不同暂养时间下的样本点），对消化腺样品和整体样品分别进行PLS-DA，并采用双标图呈现。

2.3.1 缢蛏整体风味特点分析

图2 缢蛏整体挥发性成分PLS-DA双标图Fig. 2 PLS-DA biplot for volatile components in S. constricta

如图2所示，绝大多数挥发性成分分布于相关性为100%和75%的椭圆之间，仅有含氮化合物N5、N7和酯类Z12、Z13位于50%的椭圆内，说明该模型可以较好地解释X、Y数据集的相关性关系。此外不同暂养时间的样本点均远离坐标原点，且相距较远，证明不同暂养时间的挥发性成分差异大。

由表1可知，造成缢蛏鱼腥味、泥土味、粪臭味等不良风味的物质主要为直链饱和醛（Q1、Q7、Q22、Q24、Q25）、苯酚类（B2、B3）、含氮化合物（N7）。直链饱和醛类具有阈值低、刺激性大的特点，其中己醛、癸醛、壬醛、辛醛等会产生刺鼻、油脂氧化等令人不愉快的味道[8]。有研究表明[9]，十一烷醛、癸醛、壬醛、辛醛分别来自于8-，9-，10-，11-氢过氧化异构体的分解，而戊醛、己醛、2-庚醛、2-壬烯醛是由于亚油酸的自动氧化。这些物质大都分布于图2中的右下角且临近边界，对于缢蛏整体风味影响很大。而未经暂养的对照组（F0）分布于第4象限，与这些不良风味物质有较强的相关性，说明未经暂养的缢蛏具有较为强烈的土腥味。在对照组（F0）附近聚集着许多短链脂肪酸甲酯，如辛酸甲酯、壬酸甲酯、癸酸甲酯等，这些酯类具有愉悦的花香、水果、甜味、青味，但由于这些物质的阈值相对较高，因此对整体气味的贡献较低。文献[10-11]所报道的缢蛏风味物质中酯类的种类和含量都很少，而本实验所检出的酯类物质含量较多，这可能与缢蛏种类及检测方式更为灵敏有关。此外，一些不饱和醇也与F0组距离较近，而这些物质是新鲜水产品清香味的主要来源[12]。饱和醇类的阈值较高，因此被认为对水产品风味的形成贡献不大，但C8、C9等不饱和醇，赋予水产品青草味、黄瓜味、西瓜味、蘑菇味等特殊风味[13]，本研究中含量较高的1-辛烯-3-醇（蘑菇香、蔬菜香）是一种重要的气味物质，在真菌蘑菇中最为常见，是构成蘑菇香气含量最高的化合物[14]；但也有研究表明1-辛烯-3-醇与吲哚共同作用，可能会产生金属味、土腥味等不愉快味道[15]，而且它还是构成鱼腥味的重要化合物[16]，1-辛烯-3-醇产生的原因可能是脂肪氧化酶对亚油酸的氧化分解，催化含有顺1,3-戊二烯结构的多不饱和脂肪酸，生成氢过氧化物，再经过氧化物裂解酶生成1-辛烯-3-醇等物质[17]。因此未经暂养处理的缢蛏风味较为复杂且浓烈，主要以腥味、青味为主，同时也具有花香、水果香。

暂养8 h缢蛏整体（F8）附近风味成分少，但与具有青味、草味、脂肪香气、植物味的不饱和醛（Q4、Q6、Q11、Q16）共同位于PC2的负半轴，目前相关研究可以证明：不饱和醛通常来源于亚油酸等多不饱和脂肪酸的降解[18-19]。低于C10的不饱和醛和醇，是新鲜贝肉的重要气味物质[20]，其中一些分子质量低的醛类化合物，尤其是烯醛、二烯醛对特征风味贡献较大，本研究所测得的此类物质主要有2-辛烯醛、反-2-辛烯醛、2-壬烯醛、2,4-庚二烯醛等，有青香及脂肪的气息。这说明暂养8 h缢蛏风味强度与对照组（F0）相比明显减弱，更加柔和，其特质性气味为黄瓜味、青味、清新植物味。

暂养24 h缢蛏整体（F24）位于Y轴正方向，与具有特征性气味的挥发性成分集中区域方向相反，证明暂养24 h缢蛏整体挥发性成分改变明显，已经明显失去水产品缢蛏最初的原有风味特征。虽然这些样本点周围零星分布有丙酸甲酯、3-苯甲酸甲酯、2-癸酮等具有花果气味特征的风味成分，但由于这些物质阈值过高，对于缢蛏特征性风味的形成贡献程度有限，无法逆转由于不饱和醛、酮含量降低所造成的风味损失。此外，在F24样本点附近，还分布有一些不良风味因子如庚酸（酸臭、汗臭、霉臭）、对甲苯酚（动物味）[21]，使得缢蛏整体的感官品质下降。

2.3.2 缢蛏消化腺风味特点分析

图3 缢蛏消化腺挥发性成分PLS-DA双标图Fig. 3 PLS-DA biplot for volatile components in the digestive gland of S. constricta

由图3可知，挥发性组分在双标图中分布较为松散，绝大多数挥发性成分分布于相关性为75%和50%的椭圆之间。其中未处理（S0）组位于第4象限，与其相距较近的特征性风味物质主要为具有新鲜、青味、脂肪味、花瓣、坚果的醛类，以及甜香、花香、酒香的酯类，如苯甲醛、2,4-辛二烯醛、戊醛、2-壬酮等。其中苯甲醛具有独特的杏仁味芳香味，是海产品中普遍存在的风味物质，有研究认为，它可能是形成杂环化合物的重要中间体，有助于提高整体风味质量[22]；而2,4-辛二烯醛、戊醛、癸醛是缢蛏和牡 蛎等的优良饵料骨条藻、威氏海链藻的特征性挥发性物质，在鱼虾贝等海产品特征性风味的形成中起到重要作用[23]。但也有诸多研究指出，当这些烯醛含量过高时会使水产品呈现出较重的腥味与哈喇味，如戊醛是许多海产品的重要腥味来源；此外酮类物质也是水产品风味的重要来源，有研究表明2-壬酮、2-庚酮是雪蟹中的主要酮类物质，且经过加热煮制后含量明显增加[24]，2-壬酮具有青味、泥土味、草腥味，在鱼腥草中含量较高，赋予鱼腥草特殊的腥味[25-26]。目前认为酮类化合物可能产生的方式有多不饱和脂肪酸的热氧化降解、氨基酸的降解以及微生物的氧化等，也可能是由碳链发生β氧化后再经脱羧形成的[27]。由以上分析可知，对照组缢蛏消化腺含量较高、影响较大的风味成分常见于微藻饵料、植物中小分子代谢产物，这可能是由于未经暂养处理的缢蛏消化腺内含有较多食物残渣，这些食物残渣经过微生物的发酵分解，产生小分子的挥发性物质，这些物质既是海产品清香味的重要来源，但同时也会造成样品的海腥、草腥味。

暂养8 h组（S8）位于第1、2象限，与风味成分集中的Y轴负半轴方向相反，说明S8组与S24及S0组气味差异较大，且强度更低。与S8组距离较近的风味成分主要为低级酯类如3-苯丙酸甲酯、癸酸甲酯、壬酸甲酯、丙酸甲酯等，这些低级脂肪酸甲酯常见于水果、鲜花中，具有柑橘香、花香、蜜瓜香等香气特征。此外2-戊基呋喃在该组含量较高，具有豆香、果香、泥土香味，且阈值较低，仅为6 μg/kg[28]，因此它在呋喃类物质中是缢蛏风味的主体成分。丙醛、2-十一醛为S8组特征性醛类，赋予样本清香和水果香气。

暂养24 h缢蛏（S24）与未处理组（S0）均位于Y轴负方向，因此S24组的风味特征与未处理组S0类似。在该区域中影响较大的风味化合物为C6～C10的醛类，这些醛类具有青味、土味、腥味等风味特征，如庚醛、E-2-壬烯醛、二甲基硫醚是海洋味、干鱼味、土腥味的重要来源，而己醛、壬醛、2,6-壬二烯醛等具有强烈的青草、蔬菜味。S0组的挥发性物质可能来自于消化腺残留的微藻饵料以及养殖水体中的嗅味物质，尤其是二甲基硫醚在该组含量最高，它是海产品腥味的来源之一，低浓度时表现为青草味、海水味、玉米味[12]，海洋中的二甲基硫主要存在于微藻细胞中，一些贝类、鱼类可通过摄食直接在体内积累，同时也有可能通过组织结构中含硫物质的降解，产生挥发性硫化物。生物体内含硫化合物主要有以下3 种存在形式：含硫氨基酸如甲硫氨酸、半胱氨酸；含硫维生素如VB1；含硫多肽如谷胱氨肽等。这些物质经过微生物酶的催化作用，降解生成二甲基硫醚、三甲胺等[29]。而S24组的挥发性物质可能来自于胃肠道内微生物的分解代谢产物，一些有可能为主要挥发性成分如醛类等也可能是由于受这些微生物的生长繁殖和代谢活动的影响，因而并未呈现出整体中挥发性成分含量介于消化腺和肌肉之间的这种结果。但当进行短时间暂养时，缢蛏通过滤水、排泄等生理活动，将食物残渣、泥沙排出体外，此时微生物总量少，分解有机物的能力较弱，因此S8组中挥发性成分呈下降趋势，土腥味强度最弱。

2.3.3 缢蛏肌肉风味特点分析

由图4可以看出，挥发性成分大多集中在50%的椭圆内，并以原点为中心呈辐射状分布，仅有少部分的成分因子集中于X轴正半轴区域，与未处理组M0距离较近。这说明缢蛏肌肉的各种风味较为平衡，且强度较低。此外各样本点距离较近，大多分布于原点周围，说明不同时间点样品的挥发性组成差异较小，与PCA得分图相一致（图1），符合缢蛏肌肉气味清香、滋味柔和的风味特点，同时反映出暂养对缢蛏肌肉的风味改变作用不明显。

图4 缢蛏肌肉挥发性成分PLS-DA双标图Fig. 4 PLS-DA biplot for volatile components in meat of S. constricta

3 讨 论

贝类消化腺中残留有泥沙微藻、浮游生物残渣以及排泄物，会造成腥味及沙粒感等不良感官体验，因此从采捕到上市流通前通常需要暂养净化，使得富集于贝类消化腺中的菌落总数下降、食物残渣以及泥沙排出，可以提高贝类的感官品质。而暂养水体及暂养时间是决定暂养效率和效果的重要参数，本实验主要研究暂养时间这一参数对缢蛏挥发性成分的影响。

从缢蛏整体来看，暂养8 h（F8）与未处理组F0组挥发性成分组成相似，但F8组与风味因子集中区域具有一定距离，说明暂养8 h的缢蛏整体在保留原有独特风味的同时，由于不良气味强度下降使得缢蛏更加适口。从缢蛏消化腺来看，新捕捞的缢蛏消化腺含有大量未排出的粪便和食物残渣、泥沙以及富集于肠道内的致嗅物，通常被认为是缢蛏不良口感水草味和土腥味的主要来源，通过短时间暂养缢蛏的挥发性组分含量下降明显（表1），但当暂养时间过长时，许多成分的含量又呈现回升趋势。因此为尽可能消除缢蛏消化腺对于整体风味的影响，暂养8 h效果要优于24 h。从缢蛏肌肉来看，暂养对于其风味改变不大，由此可以推断缢蛏整体的风味变化主要是由于消化腺中挥发性成分的变化，短时间的暂养可以使胃容物及泥沙排空；但当暂养时间过长，缢蛏特征性风味逐渐消失，同时消化腺中微生物的代谢活动以及缢蛏自身脂肪酸、氨基酸的降解均可导致不良风味成分增加。可见8 h是最佳的暂养时间，即可使缢蛏在保留其清香、海洋味、甘甜等风味特点，又能较大程度地降低腥味、泥土味等不良气味，感官品质得到提升。