接种量对草莓酒发酵特性的影响

马欣娟，吕慧威，孙玉梅*

（1.大连工业大学 生物工程学院，辽宁 大连 116034；2.吉林师范大学 博达学院，吉林 四平 136000）

草莓（Fragaria ananassa）营养丰富，果实鲜红色，质软而多汁，香味浓厚，略酸微甜，富含多糖、氨基酸、维生素、矿物质及多酚类生物活性物质，具有抗癌、抗氧化、预防心血管疾病等多种功效[1]，深受大众喜爱。草莓的收获期十分集中，保质期短，采摘之后极易碰伤变质，贮藏运输中腐烂比例较高[2]。将草莓加工成兼具风味和营养的果酒，是提高草莓利用价值的一种重要途径。

影响果酒发酵特性的因素有很多，其中酵母菌接种量是一个比较重要的因素。在果酒的酿造中，酵母菌主导酒精发酵的过程，一般认为，接种量越大，起酵时间越短，降糖速率越高，耗糖量也越大。但是，较高的接种量却导致酒精度降低，酒体中的杂醇油含量升高，酯类含量减少[3-5]。然而，酵母接种量较低时，整个酒精发酵过程缓慢，最终酿制的果酒中酒精度较低，挥发酸的量较高，由此可见，过低的酵母接种量也不利于果酒的酿造[4，6]。对于不同的果酒，最适宜的酵母接种量也不一样，西瓜酒的最佳干酵母用量为0.4 g/L[6]，芡实酒适宜的干酵母用量为0.5 g/L[7]，桑葚酒干酵母用量为0.6 g/L时发酵效果最好[8]，葡萄酒的最适接种量一般在1×106～1×107CFU/mL[9]。目前，对草莓酒的研究大都集中在发酵工艺[10]、酿酒微生物及草莓酒发酵特性方面[11]，对其接种量的研究较少。

本研究以裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）为发酵菌株，分别采用不同接种量（3%、5%、7%、9%（V/V））进行草莓酒发酵，并通过测定降糖速率、产酒精能力、产酸量及香气成分含量，考察不同接种量对草莓酒发酵特性的影响，以期确定较适宜的接种量，为草莓酒的研制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

丰香草莓：大连市水果市场；裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）：本实验室选育及保藏[12]。

果胶酶（酶活20万U/g）：河南洛阳夏盛果汁果胶酶有限公司；二氯甲烷（分析纯）：北京北化精细化学品有限责任公司；主要香气成分（正丙醇、异丁醇、乙酸异戊酯、正丁醇、乙酸正戊酯、己酸甲酯、异戊醇、丁酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、β-苯乙醇）标准品：天津基准化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

S-3C雷磁pH值计：上海精密科学仪器有限公司；WYT-5手持糖量折光仪：上海大庆光学仪器厂；GC8900型气相色谱仪：山东经纬分析仪器有限责任公司。

1.3 试验方法

1.3.1 草莓酒加工工艺流程及操作说明

草莓→拣选→破碎→果浆→调配→酶解→接种发酵→成品

果浆制备：选择成熟度较高、无霉烂和损伤的草莓鲜果，除萼片，采用榨汁机适度破碎，得草莓果浆。

调配：在果浆中加蔗糖调整糖分为22°Bx，并在其中加入60 mg/L SO2（偏重亚硫酸钾）和0.05%果胶酶。

酶解：加入0.05%果胶酶，在40℃酶解90 min。

酵母活化液制备：取10°Bx麦汁斜面保藏的酵母菌种2环，接入5 mL浓度为10%蔗糖水溶液中，于30℃静置培养24 h。将上述培养液接入至100 mL稀释2倍的草莓汁，在30℃摇床（100 r/min）条件下培养24 h，使酵母液浓度达到1×109CFU/mL[11]。

接种：按照一定接种量接入活化酵母液。

草莓酒发酵：将处理完的果浆分装至无菌三角瓶（300 mL/500 mL），在无菌条件下接入酵母活化液，充分混匀，用8层纱布封口，于25℃静置发酵，每隔12 h摇瓶1次，第4天用发酵栓替换纱布，再静置发酵9 d，当发酵液无气泡产生时终止发酵[12]，即得草莓酒。

1.3.2 接种量对草莓酒发酵性能的影响

以裂殖酵母为发酵菌株，分别采用不同接种量（3%、5%、7%、9%（V/V））进行草莓酒发酵，并通过测定降糖速率、产酒精能力、产酸量及香气成分含量，考察不同接种量对草莓酒发酵特性的影响。

1.3.3 分析检测

还原糖含量测定采用斐林试剂滴定法[13]；可溶性固形物含量采用手持糖量折光仪直接测定法；pH值采用pH计直接测定法；滴定酸含量测定采用电位滴定法[13]；酒精和香气成分含量测定采用气相色谱法。

样品预处理：取8层纱布过滤的酒样20mL，和等体积去离子水一同常压蒸馏，收集馏出组分35 mL，分别用15 mL、10 mL、10 mL二氯甲烷萃取3次，合并有机相，供气相色谱测定香气成分含量。

气相色谱条件：采用FFAP石英毛细管色谱柱（30 m×0.32mm，0.5μm）；程序升温：在40℃维持5min，再以15℃/min升至180℃；火焰离子化检测器（flame ionization detector，FID），进样口温度均为250℃；载气为氮气（N2），流量30mL/min，氢气（H2）流量30 mL/min，空气流量300 mL/min；分流比为1∶50；柱前压为0.1 MPa；进样量为1 μL[10]。

定性定量方法：色谱峰保留时间是定性分析的依据，而色谱峰面积则是定量分析的依据。

1.3.4 数据分析

所有实验均重复3次，数值表示为3次独立实验的平均值±标准偏差。使用Excel 2010进行数据处理。使用IBM SPSS Statistics19.0进行显著性差异分析，然后以P＜0.05的水平确定Duncan。

2 结果与分析

2.1 接种量对草莓酒发酵还原糖和可溶性固形物含量的影响

图1 不同接种量对草莓酒还原糖（A）及可溶性固形物（B）含量的影响Fig.1 Effects of different inoculum on reducing sugar(A)and soluble solids(B)content in strawberry wine

由图1A可知，在不同接种量（3%～9%）的草莓酒发酵过程中，还原糖普遍处于下降状态，发酵前8 d还原糖含量急剧下降，随接种量增大，下降率依次为58%、68%、70%和70%；8～12 d还原糖含量下降较少，变化较平缓，下降率为29%、19%、13%和8%，表明主发酵基本完成。接种量在3%～9%范围内，还原糖消耗差异显著（P＜0.05）；接种量越大，还原糖消耗越多越快，这是由于酵母接种量大则用于细胞大量生长、繁殖以及代谢所消耗的营养物质就更多[5，14]。由图1B可知，可溶性固形物与还原糖含量具有相似的变化趋势，发酵前8 d可溶性固形物含量急剧下降为11.3 g/L、10.7 g/L、10.2 g/L和10.1 g/L；8～12 d可溶性固形物含量下降较少，变化较平缓，随接种量增大依次下降为10.0 g/L、9.1 g/L、9.3 g/L和9.5 g/L。从还原糖和可溶性固形物含量变化来看，7%和9%的接种量可以提高发酵前期还原糖消耗率，减少可溶性固形物含量。

2.2 接种量对草莓酒发酵pH值和滴定酸度的影响

图2 不同接种量对草莓酒pH值（A）及滴定酸度（B）的影响Fig.2 Effects of different inoculum on pH(A)and titratable acidity(B)of strawberry wine

柠檬酸是草莓果实中的主要有机酸，约占总酸的80%[15]，适当的酸含量才能使酒醇厚、协调、适口。为了提高草莓酒的清爽适口感，可以在原料草莓制浆阶段补加酒石酸等有机酸[16-17]。由图2可知，发酵前2 d的pH下降，随后一直升高；发酵前6天滴定酸度升高，随后降低，在发酵后期又有所回升。在发酵2～6d以及8～12d期间，pH值和滴定酸度均升高，如发酵2～6d时，7%接种量的pH值由3.18升高至3.22，滴定酸度由7.76 g/L升高至8.62 g/L；发酵8～12 d，pH值由3.29升高至3.31，滴定酸度由8.28 g/L升高至8.31 g/L，这可能是代谢生成的有机酸解离度较低所致。发酵终点的滴定酸度和pH有显著差异（P＜0.05），随着接种量由5%增加至9%，滴定酸度降低，pH值升高。由于酵母菌生长要消耗发酵体系中的氧气，接种量越大，菌体生长量越大，体系耗氧越多，剩余溶氧越少，酵母菌好氧代谢受到限制，也抑制了好氧醋酸菌的生长，导致产酸量较低，pH值较高。3%、5%接种量的产酸量低，这可能是由于前者酵母菌数量少，糖代谢程度较低、速率较慢，生成醋酸的底物也较少导致的。从pH和滴定酸度变化来看，不同接种量有显著差异（P＜0.05）；7%和9%的接种量能明显降低草莓酒的滴定酸度，并提高pH值。

2.3 接种量对草莓酒发酵酒精含量的影响

图3 不同接种量对草莓酒酒精含量的影响Fig.3 Effects of different inoculum on alcohol contents of strawberry wine

由图3可知，接种量对草莓酒发酵过程的酒精生成及终浓度有显著影响（P＜0.05）。7%接种量在第6天就进入产酒精稳定期，而3%和5%接种量在发酵第10天产酒精才接近稳定，这说明在一定范围内接种量越大，产酒精越快越多，越早进入稳定期。这是由于接种量较大，酵母细胞数量较多，发酵速度较快，能更快更多地利用糖类物质转化生成酒精。在整个发酵过程中，9%接种量远低于其他3个较低接种量的酒精产量，可能是接种量过大，酵母繁殖过快过多，耗糖量增大，而使用于生成酒精的糖分减少，最终减少酒精的产量。7%接种量酒精生成速率较快。

2.4 接种量对草莓酒发酵香气成分含量的影响

根据文献[18-20]报道和所试草莓酒的主要香气成分的初步分析，本研究选定乙酸乙酯、丁酸乙酯、正丙醇、乙酸异戊酯、正丁醇、乳酸乙酯、异丁醇、异戊醇和β-苯乙醇为草莓酒的主要香气成分进行测定，结果见表1。

由表1可知，不同接种量发酵草莓酒的香气成分含量中异戊醇、异丁醇和β-苯乙醇含量较高。在发酵前期（4 d），不同接种量发酵的各香气成分含量之间差异较小（P＞0.05）；随着发酵时间的延长，香气成分含量增加，在发酵8 d时各香气成分含量约增加到发酵4d时各香气成分含量的5倍；在发酵后期（12d），香气成分含量呈现出较大差异（P＜0.05）。在发酵后期，随着接种量的增大，丁酸乙酯和乙酸异戊酯含量升高；正丙醇、正丁醇和异丁醇含量降低；乙酸乙酯、乳酸乙酯和异戊醇含量先升高后降低，其中，在5%的接种量时乳酸乙酯含量最高，在7%的接种量时乙酸乙酯和异戊醇含量最高；而β-苯乙醇含量与接种量无明显的相关性（R2=0.633）。在发酵后期，3%、5%、7%和9%接种量的草莓酒中4种酯类含量的总和依次分别为0.44 mg/L、0.66 mg/L、0.68 mg/L和0.60 mg/L，5种高级醇含量的总和依次分别为30.09 mg/L、39.65 mg/L、37.89 mg/L和38.70 mg/L。3%接种量的糖代谢速率最低，用于生成高级醇和酯类的前体物质最少，酯类含量和高级醇含量明显低于其他三种接种量。9%接种量，乙醇产量最低，由乙醇和酰基辅酶（coenzyme A，CoA）合成的乙酸乙酯和乳酸乙酯含量也较低。5%和7%的接种量发酵的草莓酒均具有较高的香气质量，经人工品尝，7%的接种量发酵的草莓酒更显柔和、协调。

表1 不同接种量草莓酒香气成分含量的影响Table 1 Effect of different inoculum on aroma components contents of strawberry wine

3 结论

不同接种量的草莓酒发酵特性明显不同。在3%至7%范围内，接种量越大，降糖速率越快，产酸量越低，产酒精速度越快；当接种量达到9%时，产酒精速度反而降低；5%和7%接种量的草莓酒在允许的范围内具有较高的酯和高级醇含量。接种量为7%的草莓酒发酵降糖速率较快，产酸量适中，产酒精速度最快，同时兼具较高的香气质量和柔和协调的口感。综合分析，认为7%接种量适宜草莓酒发酵。