禽巴氏杆菌四环素耐药株转录组测序与分析

孔令严，汪 最，邵华斌，张腾飞，卢 琴，罗青平

（1. 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，武汉 430064；2.农业部畜禽细菌病防治制剂创制重点实验室，武汉 430064）

禽源多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida，Pm）是引起禽霍乱的致病菌，在家禽中属于急性、热性、高致病性传染病病原[1]。目前主要采用药物防治，一些抗生素如土霉素，金霉素等四环素类药物效果较好[2]。但由于人类在疾病治疗中大量不当地使用抗菌药物，单重或多重耐药菌株的出现对抗生素的使用带来了严峻的挑战[3]。四环素类药物属于高效、广谱抗菌药物。近年来临床分离出的Pm呈现出对四环素类药物的耐药现象，部分分离株对土霉素、四环素、链霉素等药物已达到了高度耐药[4]。细菌对抗生素耐药机制主要分为靶基因突变、质粒介导、细胞膜通透性改变和主动外排泵系统四种[5]。耐四环素类药物的机制主要包括外排泵机制、核糖体保护蛋白机制、钝化或修饰四环素的酶机制[6]三类。目前公认的Pm耐四环素类药物的主要机制是其质粒或染色体上携带一种或多种外排泵蛋白基因，其他耐药机制尚未被阐明。

利用高通量测序技术可全面了解细胞或组织中生物信息学的变化情况，研究人员基于高通量测序原理对耐药病原菌展开了转录组学的研究[7]，为挖掘相关差异基因开拓了一种新方法，从而可以更加全面的了解其耐药机理。

本研究利用RNA-seq技术对四环素（Tetracycline，Tet）敏感株与耐药株进行测序分析，从整体水平上了解禽源Pm在Tet耐药情况下菌体的调控机制，以期鉴定出耐药相关基因，为进一步研究其耐药的分子机制提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 菌株及主要试剂 禽源多杀性巴氏杆菌标准株C48-1购自中国兽药监察所；四环素耐药株（TetR）（MIC=32μg/mL）为前期本实验室体外诱导标准株C48-1获得；TSA、TSB培养基购自BD公司；核酸/蛋白紫外检测系统和BIO-RAD IQ5荧光定量PCR仪购自BIO-RAD公司；SYBR Premix ExTaqTMⅡ和Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser购自TaKaRa生物公司；RNeasy Mini Kit与RNase-Free DNase Set购自Qiagen公司；RNAClean XP Kit购自Beckman公司；Ribo-Zero rRNA Removal Kits购自Epicentre公司；Agilent Bioanalyzer 2100购自Agilent公司。

1.2 Tet耐药株的体外诱导 本研究前期采用体外递增药物浓度的方法[8]对C48-1标准株进行逐步诱导，成功获得Tet耐药株（MIC=32 μg/mL）。通过对靶位基因序列分析以及对质粒携带的tetA、tetB、tetG、tetH和tetL耐药基因的检测，排除了这几种外排泵蛋白介导耐药的可能。

1.3 细菌培养与总RNA提取 分别挑取标准株C48-1和耐药菌株TetR的单菌落转接至5 mL TSB培养基，37℃、180 r/min过夜培养；次日以1:100转接至100 mL TSB培养基，37℃振荡培养至OD600为0.7～0.9；离心收集菌体，经无菌生理盐水洗涤菌体3次后，按照RNeasy Mini Kit (Qiagen)提取试剂盒操作说明进行样品的RNA抽提，并利用Agilent Bioanalyzer 2100电泳质检合格后纯化总RNA。

1.4 测序文库构建与测序 纯化后的总RNA按照Ribo-Zero rRNA Removal Kits（Epicentre）提取试剂盒操作说明进行rRNA去除，根据Illumina公司RNA测序文库构建说明书建立测序文库，由上海伯豪生物技术有限公司用Illumina HiSeqTM2500进行文库的测序。

1.5 测序数据处理 将测序得到的原始序列（raw reads）进行过滤去杂（去除测序接头序列、重复冗余序列、低质量序列），获得高质量序列数据（clean reads）。应用bowtie2[9]进行局部比对，对预处理后reads进行基因匹配，以Pm70（NC_002663.1）全基因组作为参照序列，匹配过程中允许有2个碱基的错配。

1.6 差异基因的筛选 使用FPKM（fragments per kilobase of exon model per million mapped reads）法[9]计算基因表达量，得到差异检验FDR（false discovery rate）值的同时，根据基因的表达量（FPKM值）计算该基因在不同样本间的差异表达倍数。FDR值越小，差异倍数越大，表明表达差异越显著。在本试验分析中，差异表达基因定义为FDR≤0.05且倍数差异在2倍以上的基因。

1.7 差异表达基因的GO和KEGG富集分析 得到差异表达基因后，对差异表达基因进行GO功能和KEGG Pathway分析。首先把所有差异表达基因向Gene Ontology数据库的各个条目映射，计算每个条目的基因数目，然后应用超几何检验，找出与整个基因组背景相比，在差异表达基因中显著富集的GO条目。将差异表达基因与KEGG数据库进行BLASTX比对，获得差异表达基因相对应的信号通路注释信息。通过信号通路显著性富集确定差异表达基因参与的最主要的生化代谢途径和信号转导途径。

1.8 差异表达基因耐药基因注释 通过耐药基因数据库（antibiotic resistance genes database，ARDB）对差异表达基因的耐药性进行注释，获得耐药性相关基因的名称及其所耐受的抗生素种类等信息。

1.9 差异表达基因的荧光定量PCR验证 将1.3中提取的样品总RNA按照Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa）的反转录试剂盒制备其cDNA，置于-40℃保存备用。随机选择10个差异表达基因，以Pm保守基因16S rRNA为参照基因，利用SYBR Premix ExTaqTMⅡ（TaKaRa）在CFX96 实时定量PCR 系统（美国Bio-Rad公司）中按照MIQE 国际化标准进行检测[10]，每个试验设3次重复。

2 结果

2.1 转录组数据拼接与评估 对C48-1亲本敏感株及其Tet耐药株的总RNA提取质检合格后，共建立了4个转录测序文库，采用Illumina HiSeqTM2500进行测序，去除不合格的reads后得到可用于数据分析的clean reads，以NCBI数据库中的Pm70（NC_002663.1）全基因组作为参照，对4组clean reads进行基因匹配，结果基因比对率均达到97.73%以上，可以进行后续的数据分析。

2.2 表达差异基因的筛选 根据每个基因的FPKM值进行样本间表达基因相关性分析，TetR菌株与C48-1菌株之间的基因表达相关系数为0.907；以Q值≤0.05，差异倍数≥2为条件筛选表达差异基因。结果共筛选出442个有意义的差异表达基因，其中103个上调，339个下调（图1）。基因表达相关性散点图与火山图中，红色代表的是上调表达基因，蓝色代表的是下调表达基因，筛选出的表达差异基因中以下调表达为主。

图1 基因表达差异分布图Fig.1 Distribution of differentially expressed genes

2.3 差异表达基因的GO与KEGG富集分析以及耐药基因ARDB注释

2.3.1 差异表达基因的GO富集分析 将筛选出的442个差异表达基因进行GO功能分析，主要分为3个类别：分子功能（molecular function）、细胞成分（cellular component）、生物过程（biological process）。将442个差异表达基因通过GO富集得到69个GO条目，其中233个差异表达基因（大多数为下调表达）富集到排名前30的GO条目中（表1），差异表达基因主要集中于核糖体的结构成分、rRNA结合、电子载体活性、ATP酶活性介导物质的跨膜运动、周质空间、外膜周质空间、跨膜运输、多糖生物合成、离子转运等多个生物过程。除多糖生物合成外，其他生物过程多数富集于核糖体结合与细胞膜转运等功能，参与跨膜运输过程，表明Tet耐药可能与细胞膜运输功能及核糖体构型有密切关系。

2.3.2 差异表达基因的KEGG注释与富集性分析 筛选得到的442个差异表达基因通过KEGG数据库共注释到20个通路类别，结果发现差异基因主要分布于整体概观图96个，膜运输40个，碳代谢35个，氨基酸代谢34个，辅助因子与维生素代谢26个，翻译过程24个，脂质代谢21个以及其他通路。442个差异表达基因通过KEGG pathway富集得到90个通路条目，其中有172个差异表达基因（大多数为下调表达）富集到排名前30的通路条目中（图2），而172个差异基因中有47个基因分布在ABC转运蛋白和核糖体代谢途径中。ABC转运蛋白中上调基因21个，下调基因8个；核糖体代谢途径中18个基因全为下调，说明禽源Pm四环素耐药机制可能与ABC转运蛋白和核糖体代谢途径有关。由于双组分系统通路中差异基因大多数为上调表达，且该系统可以起到调节ABC转运蛋白的作用，所以筛选出ABC转运蛋白和双组分系统中差异极显著的前16个过量表达基因，以及核糖体代谢途径中下调最显著的4个基因（表2）。

表1 TetR菌株差异表达基因前30 GO富集表Table 1 Top 30 of GO enrichment of differentially expression genes of TetR strain

2.3.3 差异表达基因耐药基因（ARDB）注释 将TetR菌株中筛选出的442个差异表达基因在ARDB数据库中进行注释，结果共匹配出2种耐药相关基因且上调倍数显著，分别是核糖体保护蛋白（tnaA）、主要易化子超家族转运蛋白（PM_RS03880）（表3），进一步说明禽源Pm四环素耐药可能是由外排泵转运蛋白的过量表达和核糖体保护蛋白协同作用所引起。

图2 差异表达基因的KEGG通路分类统计图Fig.2 KEGG pathway classifi cation statistical fi gure of differentially expressed genes

表2 ABC转运、双组份系统和核糖体代谢通路中差异表达基因Table 2 Differentially expression genes of ABC transporters、two-component system and ribosome pathway

表3 TetR菌株耐药基因注释表Table3 Resistant genes annotation of TetR strain

2.4 差异基因的mRNA荧光定量PCR检测 按照MIQE标准检测发现，qRT-PCR 的检测结果与RNA-Seq分析结果一致（图3），10个差异表达基因在qRTPCR 和RNA-Seq中的诱导表达变化趋势相同，证实了RNA-Seq 分析结果的可靠性。两种分析方法检测出的表达倍数有一定差异，这可能与两种检测方法的检测范围和灵敏度不同有关。

图3 TetR差异表达基因验证Fig.3 Validation of differentially expression genes by qRT-PCR

3 讨论

四环素类抗生素是抑制细菌蛋白合成的一类广谱抗生素，因其对禽巴氏杆菌有良好杀灭作用而被广泛应用，但随之而来的细菌耐药性问题也日趋严重。在国内，关于巴氏杆菌对四环素类抗生素耐药机制的研究报道相对较少，而国外学者对耐药机制的研究主要关注于Pm可在质粒上携带tetA、tetB、tetG、tetH和tetL等多种四环素类外排泵蛋白基因[11]，其他耐药机制则未见详细研究报道。

本研究前期采用体外逐步诱导法对禽源Pm亲本敏感株进行诱导，成功获得TetR耐药株，并对TetR耐药株进行了耐药基因tetA、tetB、tetG、tetH和tetL的检测，结果并未检测到上述耐药基因，从而排除了这几种外排泵蛋白介导耐药的可能性。

本研究将差异表达基因富集到排名前30的GO条目中发现，差异表达基因一方面集中于核糖体的结构成分，而核糖体的结构成分变化可能与核糖体的构型变化有关。有研究表明核糖体保护蛋白与核糖体结合可引起核糖体构型的改变，从而使四环素不能与其结合，但并不改变或阻止自身蛋白的合成[12]。差异表达基因另一方面集中于周质和外膜周质空间的变化，许多外排泵蛋白存在于双分子脂膜中，以亲水氨基酸环凸出到周质和外膜周质空间，从而外输泵蛋白逆浓度梯度将四环素-阳离子复合物泵出胞外[13]，表明外排泵介导了四环素耐药。因此四环素耐药可能与外排泵系统和核糖体保护蛋白有关。

对差异表达基因进行通路分析发现，富集到前30通路条目中的绝大部分基因都分布于ABC转运蛋白与核糖体代谢途径中。米阳等[14]将分离株MZ1006外排泵ABC转运蛋白基因msbA和spab敲除后，发现其对克拉霉素、氯霉素、氧氟沙星和利福平的敏感性显著上升，说明ABC转运蛋白可以起到多重耐药的作用。

核糖体代谢途径中PM_RS01130（rpmE）下调最显著，rmpE编码50S核糖体蛋白L31，有研究表明缺失rpmE基因的沙门氏菌会影响镁离子运输蛋白mgtA的转录水平[15]。四环素穿过细菌外膜是以被动转运阳离子(可能是Mg2+)-四环素复合物的形式经OmpF、OmpC 孔蛋白通道[16]，所以PM_RS01130可能是一个重要的耐药相关基因。另外3个下调基因PM_RS09065、PM_RS09070、PM_RS07215均编码30S核糖体蛋白，四环素类抗生素通过与胞内核糖体30S亚基形成可逆结合体，抑制蛋白质合成，起到抗菌效果[17]。多个核糖体基因的下调是一种自我保护机制，可能是由保护核糖体蛋白与核糖体结合所引起的。

ABC转运蛋白与双组分系统通路中差异基因大多数为上调表达。Sebastian等[18]发现双组份系统与ABC转运蛋白之间有着密切的关联，它们可以调控对刺激的感知、信号的传导以及通过Bcelike解毒系统起到耐药作用。两条通路上调的基因中PM_RS08570、PM_RS04835、PM_RS07920、PM_RS01405编码的蛋白均为C4-二羧酸盐ABC转运蛋白，其有5个不同种类的蛋白，分别为DctA、DcuA、DcuB和两个同源的DcuC，它们通过双组份RacRS系统来应对低氧和高硝酸盐环境，调控C4-二羧酸盐跨膜运输[19]，这类蛋白很可能是介导四环素耐药的外排泵，而 PM_RS10285和PM_RS08580编码的蛋白为C4-二羧酸盐ABC转运蛋白通透酶，能够与C4-二羧酸盐特异结合，通过自身构象的变化，将C4-二羧酸盐转移到膜的另一侧[20]。PM_RS10285编码的蛋白为ABC转运蛋白通透酶，ABC转运蛋白的核心是由跨膜域和核苷酸结合域组成，是最大的膜蛋白类之一[21]。通透酶是物质跨膜运输的载体，可能与药物的外排有关。PM_RS07150、PM_RS07145和PM_RS00780编码的蛋白均为核糖的转运蛋白或者通透酶，起到运输核糖的作用。核糖与腺苷酸的形成和三磷酸腺苷（ATP）的再生有密切关系，是生命代谢最基本的能量来源之一，可以为药物外排提供能量。

uhpT蛋白为膜转运蛋白，缺失掉uhpT基因后金黄色葡萄球菌对磷霉素MIC由0.5 μg/mL变为32 μg/mL，缺失株恢复uhpT基因后金黄色葡萄球菌对磷霉素MIC由32 μg/mL变为0.5 μg/mL[22]，表明uhpT蛋白过表达与耐药有关。PM_RS10290编码的蛋白为ABC多药外排泵，可以将对菌体有害的多种药物排出体外。差异表达基因用ARDB进行耐药基因注释后得到两种耐药相关基因，PM_RS03880编码的蛋白为主要易化子超家族的外排泵蛋白，主要介导四环素的外排作用。Manabu等[23]发现从渔场分离的细菌如含有tetY基因，就会对所有四环素类药物耐药。tnaA为核糖体保护蛋白，可以保护核糖体不被四环素阳离子复合物抑制翻译过程。

综上所述，禽源Pm对四环素耐药可能由细胞膜上多药外排泵的过量表达和核糖体保护蛋白两种耐药机制协同作用所引起。后期需要对相关耐药基因构建缺失株，以进一步验证禽源Pm对四环素耐药的机制。本研究结果为深入研究细菌耐药分子机制提供重要依据。