低氧耐力运动对营养性肥胖大鼠骨骼肌自噬蛋白表达的影响

赵芳芳 文根 吴菊花 李志刚 翁锡全 林文弢

1 广州体育学院省重点生化实验室（广州510500）

2 吉林大学珠海学院

3 广西科技大学体育学院

4 百色学院体育学院

自噬（Autophagy）作为真核生物体内存在的自我保护机制，在机体能量代谢中发挥着重要的作用。研究表明，长期高脂饮食会抑制大鼠体内自噬相关因子的活性[1]，而运动可激活机体的细胞自噬，并使细胞自噬相关因子的表达出现不同程度的提高[2，3]。除运动外，低氧亦可诱导自噬的发生，薄海等[4]研究发现，在低氧状态下进行中等负荷有氧运动训练，可提高骨骼肌线粒体ATP 输出，抑制活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成，线粒体膜蛋白PTEN 诱导激酶1（PTEN induced putative kinase 1，PINK1）、Parkin和Bcl-2/腺病毒E1B 19 k Da 结合蛋白（Bcl2/adenovirus E1B 19 kDa interacting protein 3，BNIP3）表达量显著升高，提示低氧可显著促进线粒体自噬增加。同样，亦有研究表明，营养性肥胖大鼠在低氧条件下运动，其腓肠肌自噬相关因子P62、LC3、Beclin1的表达具有显著性提高[5]。而运动或低氧作为防治肥胖的有效干预手段是如何调控细胞自噬，发挥防控代谢性疾病的作用，值得进一步探讨。因此，本研究通过建立营养性肥胖大鼠模型，并对其进行不同浓度的低氧或结合耐力运动干预，探讨在持续性高脂饮食的条件下，低氧、运动、低氧结合运动对骨骼肌细胞自噬相关蛋白微管相关蛋白1 轻链3（Microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）、酵母ATG6 同源物（Beclin1）、AMPKα2、Sestrin2 表达的影响，旨在为代谢性疾病的防治提供理论依据和实验支撑。

1 材料与方法

1.1 低氧耐力训练模型

选取建模成功的营养性肥胖大鼠80只，按不同浓度的低氧分为安静组和运动组（具体分组情况如表1），每组各10只，进行1周（第1～6天）常氧跑台适应性训练和1 周（第8～13 天）低氧结合耐力运动适应性训练（大鼠适应期训练方案见表2）。正式试验干预期，大鼠训练方案如下：运动组大鼠均进行中等强度耐力运动，其中时间为40 min，跑台坡度为0，跑速为20 m/min；运动频率为一周5次（每周一到周五），持续8周。其中，A组大鼠不进行任何干预，AE组大鼠进行常氧中等强度耐力训练，B 组、C 组、D 组分别给予氧浓度为16.3%、13.3%、11.3%的低氧暴露（在相应的低氧环境下，每天进行连续12 h 低氧干预，干预时间为早8：00 到晚8点），其中BE组和CE 组、DE组大鼠分别给予氧浓度为16.3%、13.3%、11.3%的低氧暴露并增加中等强度耐力运动训练（低氧暴露时间与低氧组相同，但在晚7点进行40 min的低氧耐力训练）。

表1 低氧运动训练大鼠分组情况（各组n=10）

表2 适应期运动方案

1.2 动物取材

末次低氧耐力训练结束后，禁食24 小时，称量大鼠体重并测体长，腹腔注射10%水合氯醛溶液（按0.3 ml/100 g体重剂量）进行大鼠麻醉，腹部解剖，取腓肠肌组织称重，并取一侧腓肠肌冰上匀浆抽提总蛋白，另一侧腓肠肌置冻存管于液氮中速冻，随后于－70℃超低温冰箱保存，待测。

1.3 Western blot法测定骨骼肌自噬相关蛋白

骨骼肌总蛋白提取：电子天平称取100 mg 腓肠肌并剪碎，放入1 ml RIPA 蛋白裂解液（碧云天）和10 μl PMSF 蛋白酶抑制剂（康为世纪）的混合液，于冰上研磨并裂解20 min；之后，低温离心机以－4℃、12000 rpm离心15 min，上清液于1.5 mL的EP管存放。BCA 法测定蛋白浓度后与上样缓冲液于沸水中煮5 min，使蛋白变性。15%、10%分离胶，5%浓缩胶电泳；采用湿转法将蛋白转移至PVDF 膜；5%脱脂牛奶封闭过夜；一抗（LC3、Beclin1、AMPKα2、Sestrin2 均购置美国ABCAM公司）、GAPDH（美国Proteintech Group公司）均用TBST缓冲液以1∶1000和1：8000稀释，于4℃冰箱孵育过夜；二抗（Sera care 公司）以1∶5000 稀释，室温摇床孵育2 h。Western blot 结果使用Tanon（天能）5200 Multi 仪器自带软件进行灰度值分析，以目的蛋白/内参值作为目的蛋白的半定量分析。

1.4 数据统计

采用SPSS22.0 统计软件进行统计学处理，实验所得数据均以平均值±标准（x±s）表示，GraphPad Prism5进行数理统计及图像生成，组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠腓肠肌细胞Sestrin2蛋白的表达情况

由图1可知，实施低氧暴露干预后，与A组相比，C组、D 组Sestrin2 蛋白表达水平显著性升高（P＜0.05），B组有上升趋势；与B组相比，D组Sestrin2蛋白表达水平显著性升高（P＜0.05）。实施耐力运动干预后，与安静组大鼠相比，运动组大鼠腓肠肌Sestrin2蛋白表达均具有升高趋势，其中AE 组与A 组、BE 组与B 组、DE 组与D组相比Sestrin2蛋白表达水平升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。低氧结合耐力运动双重干预后，与AE组相比，BE组、CE组Sestrin2蛋白表达有上升趋势，DE组Sestrin2蛋白表达显著性升高（P＜0.05）；与BE组、CE组相比，DE组Sestrin2蛋白表达显著性升高（P＜0.05）。

图1 低氧或结合耐力运动对肥胖大鼠腓肠肌细胞Sestrin2蛋白表达的影响

2.2 各组大鼠腓肠肌细胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值的变化情况

由图2可知，实施低氧暴露干预后，与A组相比，C组、D组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值显著性升高（P＜0.05），B组具有上升趋势；与B 组相比，D 组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值显著性升高（P＜0.05）。实施耐力运动干预后，与各安静组大鼠相比，运动组大鼠腓肠肌LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均显著性升高（P＜0.05）。低氧结合耐力运动双重干预后，与AE组相比，BE组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值有上升趋势，CE组、DE组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值显著性升高（P＜0.05）；与BE组相比，DE组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值显著性升高（P＜0.05）。

图2 低氧或结合耐力运动对肥胖大鼠腓肠肌细胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值的影响

2.3 各组大鼠腓肠肌细胞Beclin1蛋白表达情况

由图3可知，实施低氧暴露干预后，与A组相比，B组、C组、D组Beclin1蛋白表达显著升高（P＜0.05），与B组、C 组相比，D 组Beclin1 蛋白表达显著升高（P＜0.05）。实施耐力运动干预后，与安静组大鼠相比，运动组大鼠腓肠肌Beclin1 蛋白表达均显著升高（P＜0.05）。低氧结合耐力运动双重干预后，与AE组相比，BE组、CE组Beclin1蛋白表达具有上升趋势，DE组Beclin1 蛋白表达显著升高（P＜0.05）；与BE、CE 组相比，DE组Beclin1蛋白表达显著升高（P＜0.05）。

2.4 各组大鼠腓肠肌细胞AMPKα2蛋白表达情况

由图4可知，实施低氧暴露干预后，与A组相比，C组、D 组AMPKα2 蛋白表达显著性升高（P＜0.05）；与B组相比，C 组、D 组AMPKα2 蛋白表达显著升高（P＜0.05）。实施耐力运动干预后，与安静组大鼠相比，运动组大鼠腓肠肌AMPKα2 蛋白表达均显著升高（P＜0.05）。低氧结合耐力运动双重干预后，与AE组相比，BE 组AMPKα2 蛋白表达具有上升趋势，CE 组、DE 组AMPKα2 蛋白表达显著升高（P＜0.05），与BE 组、CE 组相比，DE组AMPKα2蛋白表达显著性升高（P＜0.05）。

图3 低氧或结合耐力运动对肥胖大鼠腓肠肌细胞Beclin1蛋白表达的影响

图4 低氧或结合耐力运动对肥胖大鼠腓肠肌细胞AMPKα2蛋白表达的影响

3 分析与讨论

3.1 低氧或结合耐力运动对肥胖大鼠腓肠肌细胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值的影响

LC3Ⅱ被认为是自噬活动的特异性标志物，通常用LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值来衡量自噬活性，其比值下降提示自噬活性减弱，反之则说明自噬活性增强[6，7]。崔迪等[8]研究发现，肥胖小鼠进行跑台耐力训练6周后，高脂对照组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值下降，普通膳食组、高脂运动组小鼠骨骼肌p62蛋白水平下降，高脂运动组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值上调。本实验结果与之一致，经过8 周的低氧或结合耐力运动后，与常氧安静组相比，常氧运动组、低氧组大鼠腓肠肌LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值具有升高趋势，并且常氧运动组、13.3%低氧安静组、11.3%低氧安静组大鼠骨骼肌LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值显著性升高，说明耐力运动及低氧暴露可激活自噬。与常氧运动组相比，13.3%低氧运动组、11.3%低氧运动组大鼠腓肠肌LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值显著性升高，说明在一定范围内，氧浓度越低，自噬激活的效果越明显。此外，就整体而言，11.3%低氧组激活自噬效果最明显，尤以11.3%低氧耐力运动组效果显著。

3.2 低氧或结合耐力运动对肥胖大鼠腓肠肌细胞Sestrin2、AMPKa2蛋白表达的影响

Sestrin 蛋白包含三个不同的亚基，并根据特定蛋白编码的基因分SESN1，SESN2 和SESN3，并且这三种亚基包含近50%的相同氨基酸序列[9，11]。作为应激诱导型代谢调节器，Sestrins 通过多种机制帮助细胞适应各种应激刺激，包括分解代谢反应的激活、合成代谢活动的停止以及启动细胞修复机制以维持细胞内稳态[9]。Sestrins（SESN）是具有多效生物功能的高度保守的蛋白质，并且在应激条件下上调，如DNA 损伤、缺氧、饥饿、生长因子耗尽、辐射和氧化应激等[10，11]。诱导后，Sestrins 保护细胞对抗基因毒性和氧化应激，因此被命名为应激诱导型代谢调节剂[9]。Sestrin 基因的失活会导致各种细胞和代谢疾病，如氧化损伤，线粒体功能障碍，脂肪堆积，肌肉退化，加速糖尿病并发症进展[12-14]。已知Sestrin2（SESN2）是一种高度保守的应激诱导型代谢蛋白，可抑制活性氧（ROS），并为各种有害刺激（遗传毒性和氧化应激、内质网应激和缺氧等）提供细胞保护。Lee等[15]研究发现，敲除Sestrin2/3基因的小鼠在正常的饮食条件下可出现胰岛素抵抗症状，这提示Sestrins 在机体代谢调控中可能发挥着重要作用。此外，当采用si RNAs 抑制细胞SESN2 的基因表达后发现细胞自噬活性出现显著性降低[16]，这提示应激状态下细胞自噬活性的增强可能是Sestrins 发挥细胞保护作用的重要机制之一。研究发现，8 周的有氧运动可上调Sestrin2 和Sestrin3 的表达水平，并且单次急性运动可使AMPKα2 与Sestrin2 和Sestrin3 之 间 结 合 显著 增加[17]。本研究结果表明，运动、低氧均能上调Sestrin2蛋白的表达水平，经过8周低氧或结合耐力运动，运动组、低氧组、运动结合低氧组肥胖大鼠腓肠肌Sestrin2蛋白都有不同程度的提高，尤以11.3%低氧运动组大鼠腓肠肌的Sestrin2蛋白表达上调尤为显著，这可能与缺氧状态下HIF-1ɑ 和NO 的活性有关，但其具体机制仍需进一步研究。

Sestrin2 还通过激活关键能量感受器AMP 依赖性蛋白激酶（AMPK）和抑制哺乳动物雷帕霉素复合物1（mTORC1），在代谢调节中起关键作用。AMPK是一种在能量缺乏条件下激活的酶，可作为细胞中mTOR 的主要负调节因子。研究表明，Sestrin2 主要通过激活AMPK 和结节性硬化症2（TSC2）的磷酸化来抑制细胞中mTOR的活化[12，18]。在小鼠中，Sestrin2的基因切除增强了mTOR的激活，加重了肥胖相关特征，如葡萄糖耐受不良，胰岛素抵抗和肝脏脂肪变性等[12]。本研究结果表明，经过8周的低氧耐力运动，低氧或结合耐力运动均能够上调AMPKα2蛋白的表达水平，并且，在三种低氧浓度的干预下，11.3%低氧结合耐力运动的效果更为显著。本研究结果发现，运动组大鼠腓肠肌AMPKα 2蛋白表达水平要高于安静组大鼠，低氧结合耐力运动组大鼠腓肠肌AMPKα2蛋白表达水平要高于单纯低氧组。有研究发现，短暂低氧暴露（氧浓度为0.2%O2）即可增加心肌细胞AMPK 活性，且呈持续增加状态[19]。与此相似，Liu 等[20]研究发现慢性低氧暴露可增强机体大脑AMPK 的表达，进而抑制mTOR 信号通路，从而增强低氧暴露所引起的细胞自噬。本实验结果与吴菊花[21]的研究结果一致，由此可推测，低氧或结合耐力运动可正向激活AMPK 蛋白的水平。研究结果显示，氧浓度与运动的叠加效应要优先于单纯性低氧和单纯性运动，亦可推测，在一定范围内，氧浓度越低，对自噬因子AMPK的影响越显著。牛燕媚等[22]研究发现，长期进行有氧运动的小鼠，其骨骼肌中Sestrin2/3的表达水平会有显著性增加，并且其与AMPK 的结合也会显著增加。本研究结果与之相似，实验发现肥胖大鼠腓肠肌的AMPKα2 能够被运动和低氧诱导，并且其表达水平在11.3%低氧运动组尤为显著，Sestrin2蛋白表达趋势与AMPKα2 基本一致。由此，我们可以推测，Sestrins可能参与AMPK 的激活，参与长期低氧或结合有氧运动对骨骼肌自噬活性的激活，并在调节糖、脂代谢方面起到关键作用。虽然在哺乳动物中Sestrins 能够激活AMPK 已得到证实[23]，但是Sestrins 是直接激活还是与其他因子结合之后再发挥作用，其具体机制仍不清楚。Maiuri等研究发现，在营养限制或者Rapamycin干预条件下，shRNA介导的Sestrin2表达抑制显著降低了自噬活性水平[24]，综合刘效磊[17]和本实验的研究结果，可以推测Sestrins 能够正向调控AMPK 的表达，并在其上游发挥重要作用。

3.3 低氧或结合耐力运动对肥胖大鼠腓肠肌细胞Beclin1蛋白表达的影响

研究表明，低氧应激后细胞内ROS水平升高，激活了核因子κB（NF-κB）信号通路，使Beclin1 活性增高，可见Beclin1活性表现与低氧应激密切相关[25，27]。本研究结果发现，经过8周的低氧或结合耐力运动，与常氧安静组相比，其余各组肥胖大鼠腓肠肌Beclin1蛋白的表达都有上升的趋势。此外，本研究发现，与常氧安静组相比，常氧运动组大鼠腓肠肌Beclin1蛋白表达有显著性升高；与单纯性低氧暴露组相比，各低氧结合耐力运动组大鼠腓肠肌Beclin1 蛋白表达有显著性升高，11.3%低氧组Beclin1蛋白表达高于常氧组、16.3%低氧组及13.3%低氧组。由此，我们可以看出，单纯性耐力运动、低氧暴露、低氧结合耐力运动均能提高肥胖大鼠腓肠肌Beclin1蛋白表达水平。同样，Zhang等[26]报道慢性低氧可上调Bnip3和Beclin1蛋白的表达。由此可以说明，低氧与耐力运动两种刺激均可以提高肥胖大鼠骨骼肌Beclin1的表达水平，使骨骼肌细胞自噬活性增强，从而有利于维持细胞内环境的稳态，调节脂代谢紊乱。此外，低氧结合耐力运动组Beclin1表达水平明显高于单纯性耐力运动组和单纯性低氧暴露组，证明低氧和运动对大鼠骨骼肌自噬基因表达的诱导具有累积效应。

综上，低氧或结合耐力运动可激活细胞自噬，并诱导肥胖大鼠骨骼肌自噬相关蛋白表达增加，且低氧结合耐力的诱导效果要优于单纯性运动及低氧暴露。但自噬作为一种细胞保护机制，其活性过高或过低均不利于胞浆中蛋白质和细胞器生理功能的发挥，所以运动负荷、运动方式以及时间对自噬的调控还需进一步研究。

4 结论

本研究通过对营养性肥胖大鼠进行低氧耐力训练发现，运动和低氧都能显著激活骨骼肌细胞自噬，上调骨骼肌自噬相关蛋白LC3、Beclin1、AMPKα2、Sestrin2蛋白的表达水平。且与单纯运动和单纯低氧相比，低氧耐力训练对自噬的调控作用更加显著。纵观对自噬的研究，有关运动与自噬的研究尚处于起始阶段，低氧结合运动与自噬的研究更是在探索时期，因此，在之后的实验研究中，还需进一步探讨运动、低氧激发自噬的机制以及自噬适应性变化的原因。