青光安对抗青光眼术后滤过道瘢痕化中胶原纤维、α-SMA及FN的影响

黄学思，彭 俊，蒋鹏飞，李苑碧，喻 娟，彭清华

0引言

青光眼是全球第二大致盲眼病[1]，目前治疗方式是进行滤过性手术，而滤过道瘢痕化是滤过性手术失败最主要的原因。研究表明，胶原纤维、以α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)为特征表达的肌成纤维和纤维连接蛋白(fibronectin，FN)是滤过性手术后瘢痕形成的关键因素之一[2]。尽管抗代谢药物如丝裂霉素C(mitomycin C，MMC)等在手术中的应用大大挺高了手术的成功率[3]，但是此类药物广泛作用于眼部组织，会导致滤过泡渗漏、眼内感染等一系列并发症，易给患者本来已经损伤的视功能带来新的威胁[4]。本课题组自主研制的青光安颗粒剂具有活血化瘀、利水明目的功用，应用于术后抗滤过道瘢痕化疗效显著。本课题组前期通过在青光安颗粒剂中药组份库中建立高通量筛选药物体系[5-6]，已经筛选出4种青光安有效组份。本实验将4种青光安有效组份、青光安中药混悬液以及丝裂霉素C应用于手术动物模型，通过观察各组抑制胶原纤维、α-SMA和FN的表达情况，进而抑制瘢痕组织增生的效果，来对比各有效组份术后抗滤过道瘢痕化的实际疗效，为研制治疗青光眼的药物提供有力的物质基础支撑。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1实验动物SPF级新西兰长耳白兔48只(由湖南中医药大学动物实验中心提供)，体质量1.5～2.0kg，雌雄各半，实验前排除双眼及全身病变，实验动物饲养在湖南中医药大学实验楼动物实验中心SPF级实验房，湿度50%～55%，室温(23±2)℃，实验过程中对动物的处置符合2006年国家科技部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》[7]的规定。

1.1.2主要仪器设备和手术器材-80℃超低温冰箱(中科美菱，DW-HL538)、立式压力蒸汽灭菌器(上海博迅实业有限公司医疗设备厂，YXQ-LS-SⅡ)、净化工作台(苏州净化设备有限公司，SW-CJ-1D)、电热鼓风干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司，101-1AB型)、低温台式高速离心机(赫西仪器装备有限公司，HR/T 16M)、超微量分光光度计(美国，Nanodrop)、凝胶成像系统(美国，Bio-Rad)、微量移液器(德国，Eppendorf)、台式高速冷冻离心机(Thermo)、水平电转槽(北京六一仪器厂，DYCP-40C)、超纯水仪(Millipore公司)、紫外可见分光光度计(上海Spectrum公司，SP-752)、恒温摇床(金坛，THZ-82A)、水平摇床(北京六一仪器厂，WD-9405B)、扫描仪(日本Canon，9000F MarkⅡ)。

1.1.3主要药品和试剂水合氯醛(上海国药集团化学试剂有限公司，批号20151023)、丝裂霉素C、青光安4种有效组份、青光安混悬液、4%多聚甲醛、α-SMA单克隆抗体、FN单克隆抗体、SABC即用型试剂盒(武汉赛维尔生物科技有限公司)、DAB试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.2方法

1.2.1实验动物分组将48只兔按体质量平均分到A组(空白组)、B组(模型组，即手术对照组)、C组(丝裂霉素C对照组)、D组(有效组份1组)、E组(有效组份2组)、F组(有效组份3组)、G组(有效组份4组)、H组(青光安混悬液组)，每组6只兔子。

1.2.2青光眼滤过手术动物模型建立耳缘静脉注射10%水合氯醛溶液(按2～4mL/kg)麻醉兔子，使用压陷式眼压计测每只兔子术眼3次眼压取平均值(保留小数点后1位数)并记录。生理盐水冲洗术眼结膜囊后滴0.1%丁卡因进行局部麻醉，在手术显微镜下行双眼小梁切除+虹膜根部切除术[8]，除A组外，所有兔子均形成滤过泡。

1.2.3给药方法A组、B组：术后第1d开始以生理盐水10mL/kg灌胃，每日1次，持续4wk。 C组：术中切除巩膜和小梁组织前使用MMC，参照MMC在青光眼手术中的常用方法[5]，术后灌胃频率、方法、时间同A、B组。D组、E组、F组、G组：术后第1d开始以不同组份给药，体表面积折算的等效剂量比值计算[6]，算出兔子的用药剂量，溶于生理盐水中，频率、方法、时间同A、B组。H组：术后第1d开始以成人临床等效剂量的3.27倍给药，溶于生理盐水中，频率、方法、时间同A、B组。

1.2.4术后眼压测量与固定取材本实验中眼压的测量方法参照文献[8]进行。灌胃4wk后第1d取材。空气栓塞法处死兔子后，立即将眼球完整取出固定于4%多聚甲醛溶液中[9]，剪取眼球上手术区10mm×10mm范围内的方形全层眼球壁及其周边组织，制作成石蜡切片备行Masson染色。

1.2.5滤过泡区域内胶原纤维、α-SMA、FN的表达情况胶原纤维：取部分石蜡切片进行Masson染色后，在光镜400倍视野下随机选择5个高倍视野，观察胶原纤维占视野面积的比值情况，并取平均值作统计学分析。取部分石蜡切片做免疫组化后，在光镜400倍视野下随机选择5个高倍视野，测定α-SMA、FN的平均光密度，计算平均值作为样本中α-SMA、FN的表达量。

2结果

2.1术后各组眼压测量情况实验中无兔子死亡或消耗，除A组外，各组术前、术后2d，1、2、4wk眼压比较，采用重复测量数据的方差分析，不同时间点间的眼压差异有统计学意义(F=13.831，P=0.002)。B组术后2、4wk眼压相比术前，差异均无统计学意义(P>0.05)，说明B组手术2wk后眼压已基本恢复到术前水平。C组术后各时期相比术前，差异均有统计学意义(P<0.05)，说明C组在手术后眼压一直处于较低水平。D组术后4wk相比术前，差异无统计学意义(P>0.05)，说明D组所用药物组份在术后4wk对抑制眼压上升无明显作用。E组术后各时期相比术前，差异均有统计学意义(P<0.05)，说明E组所用组份对于抑制眼压上升有效。F组术后4wk相比术前，差异无统计学意义(P>0.05)，说明F组所用组份在术后4wk对于抑制眼压上升无效。G组术后2、4wk相比术前，差异均无统计学意义(P>0.05)，说明G组所用组份在术后2、4wk对于抑制眼压上升无效。H组术后各时期相比术前，差异均有统计学意义(P<0.05)，说明H组所用组份对于抑制眼压上升有效。同一时间点不同组别的眼压有差别(F=27.256，P<0.001)。术后2wk B组与A组相比，差异无统计学意义(t=0.801，P=0.221)，术后2wk G组与A组相比，差异无统计学意义(t=2.114，P=0.030)，表明手术2wk后G组对于抑制眼压上升无效，见表1。

图1各组滤过泡区域胶原纤维表达情况(Masson染色×400)A：A组胶原纤维较少，形态规则，排列整齐；B:B组胶原纤维大量增生，排列不规则；C：C组胶原纤维增生较少，排列尚规则；D：D组胶原纤维增生较多，排列较为紊乱；E：E组胶原纤维密度较低，排列尚规则；F：F组可见大量生成的胶原纤维排列不规则；G：G组胶原纤维致密粗大，排列不规则；H：H组胶原纤维排列稀疏，且边界清楚。

组别术前术后2d 术后1wk 术后2wk 术后4wk A组17.64±0.5917.17±1.3716.80±0.4616.37±0.7016.69±0.85B组16.72±1.249.50±0.95a,c13.85±0.95a,c16.02±0.8116.40±0.80C组17.15±1.148.73±0.89a,c9.33±1.07a,c10.56±1.39a,c11.08±1.73a,cD组16.51±1.389.08±0.78a,c11.54±0.98a,c14.16±1.06a,c15.63±1.63E组17.55±0.889.25±0.59a,c11.49±0.89a,c12.11±0.99a,c13.77±0.69a,cF组17.84±1.129.19±0.98a,c11.60±0.91a,c14.54±1.23a,c15.13±1.80aG组17.55±1.069.58±0.85a,c12.22±0.79a,c15.58±0.5916.42±0.51H组18.26±1.089.25±0.67a,c10.93±0.80a,c11.88±0.79a,c13.49±0.62a,c

注：A组：空白组；B组：模型组，即手术对照组；C组：丝裂霉素C对照组；D组：有效组份1组；E组：有效组份2组；F组：有效组份3组；G组：有效组份4组；H组：青光安混悬液组。aP<0.05vsA组；cP<0.05vs同组术前。

2.2滤过泡区域胶原纤维表达情况各组滤过泡区胶原纤维面积比值相比A组(0.0512±0.0078)，差异均有统计学意义(P<0.05)，说明各组滤过泡区胶原纤维都有不同程度增殖。D组(0.1774±0.0047)、G组(0.1829±0.0188)相比B组(0.1840±0.1505)，差异均无统计学意义(t=0.1074，P=0.458；t=0.0178，P=0.493)，说明D组和G组所用药物组份对于抑制胶原纤维增殖基本无效。C组(0.0732±0.0109)、E组(0.0824±0.0105)、F组(0.1294±0.0375)、H组(0.0970±0.0150)相比B组，差异均有统计学意义(P<0.05)，说明E组、F组采用的药物组份对于抑制胶原纤维增殖有效。H组相比E组，差异无统计学意义(t=-1.953，P=0.960)，说明其抑制胶原纤维增殖的效果与E组无明显差异。各组胶原纤维表达情况见图1。

2.3滤过泡区域α-SMA表达情况各组α-SMA平均光密度相比A组(0.290±0.032)，差异均有统计学意义(P<0.05)，说明各组肌成纤维都有不同程度增殖。G组(0.594±0.042)相比B组(0.606±0.036)，差异无统计学意义(t=0.531，P=0.303)，说明G组药物组份对于抑制α-SMA增殖基本无效。而C组(0.392±0.047)、D组(0.543±0.038)、E组(0.459±0.046)、F组(0.493±0.024)、H组(0.424±0.030)相比B组，差异均有统计学意义(P<0.05)，说明D组、E组、F组所用的药物组份对于抑制α-SMA增殖有效。H组相比E组，差异无统计学意义(t=1.561，P=0.075)，说明其抑制α-SMA增殖的效果与E组无明显差异。各组α-SMA表达情况见图2。

图2各组滤过泡区域α-SMA表达情况(SABC×400)A：A组正常组织α-SMA含量少，阳性细胞不明显；B：B组α-SMA高度表达，排列致密，形态不规则；C:C组α-SMA表达较少，排列稀疏；D：D组α-SMA表达明显增高；E：E组α-SMA表达较C组有所增加，但排列尚整齐；F：F组α-SMA表达较E组有所增加，排列不规则；G：G组α-SMA表达明显增高，排列不规则；H：H组α-SMA表达不明显，排列较稀疏。

图3各组滤过泡区域FN表达情况(SABC×400)A:A组正常组织中FN表达较少；B：B组FN高度表达，排列致密，形态不规则；C:C组FN表达较正常组高，但是低于其他组；D：D组FN表达明显增高，仅次于B组；E：E组FN表达较C组高，排列尚整齐；F：F组FN表达较E组多，且排列致密；G：G组FN呈高度表达，排列紊乱致密；H:H组FN表达较C组增高，但不及E组，排列较稀疏。

2.4滤过泡区域FN表达情况各组FN平均光密度相比A组(0.250±0.075)，差异均有统计学意义(P<0.05)，说明各组FN都有不同程度增殖。D组(0.625±0.077)、G组(0.592±0.073)相比B组(0.642±0.067)，差异均无统计学意义(t=0.408，P=0.346；t=1.236，P=0.122)，说明D组、G组药物组份对于抑制FN增殖基本无效。而C组(0.368±0.038)、E组(0.447±0.110)、F组(0.540±0.090)、H组(0.390±0.077)相比B组，差异均有统计学意义(P<0.05)，说明这些组对于抑制FN增殖都有不同程度的效果。H组相比E组，差异无统计学意义(t=1.040，P=0.161)，说明其抑制FN的增殖效果与E组无明显差异。各组FN表达情况见图3。

3讨论

青光眼滤过性手术术后滤过道瘢痕化是青光眼滤过性手术失败的主要原因[9]，目前普遍认为瘢痕形成主要与胶原纤维合成增多、成纤维细胞以及肌成纤维细胞的增生有关。α-SMA是肌成纤维细胞的重要构成部分[10]，其在肌成纤维细胞中的高表达会使肌成纤维细胞处于活化状态[11-12]，肌成纤维细胞合成胶原的能力显著提升，最终瘢痕形成，导致青光眼滤过性手术失败[13]。FN是对胶原蛋白有特殊亲和力的高分子糖蛋白，创伤处的成纤维细胞合成纤维连接蛋白[14]，构成细胞外基质的骨架，参与抗青光眼滤过性手术术后瘢痕形成[15]。

青光安颗粒剂是彭清华教授在中医理论的指导下，以益气养阴、活血利水为原则，研制而成中药复方制剂[16]。青光安颗粒剂能明显减少术后滤过道瘢痕的形成，前期的动物实验研究未发现青光安颗粒剂4种有效组份对眼部组织的毒副作用，可能成为抗青光眼术后滤过道瘢痕化，提高手术成功率的一个全新安全药物。为了进一步研究青光安抗青光眼术后滤过道瘢痕化的作用机制，本课题组前期通过对青光安50多种中药组份建立高通量筛选体系，筛选出4种青光安有效组份，它们均可以有效抑制成纤维细胞增殖，减少细胞外基质的合成，抑制青光眼术后滤过道瘢痕化。

本实验以青光安4种有效组份与空白组、模型组、MMC组及青光安混悬液组进行比较，在术后眼压方面、滤过道瘢痕化方面对4种组份的疗效进行了研究，结果发现MMC组、有效组份2组和青光安混悬液组能有效控制青光眼滤过性手术术后眼压；MMC组、有效组份2组、有效组份3组和青光安混悬液组均可有效抑制胶原纤维增殖，其中MMC组效果最佳；MMC组对α-SMA增殖有明显的抑制作用，有效组份2组、有效组份3组与青光安混悬液组也可有效抑制α-SMA增殖，有效组份1组与有效组份4组对α-SMA增殖几乎无抑制作用；MMC组对FN增殖有明显抑制作用，青光安混悬液组、有效组份2组及有效组份3组对FN增殖均有抑制作用，有效组份4组与有效组份1组对FN增殖抑制作用不明显。

本实验表明，MMC、青光安有效组份2、青光安有效组份3及青光安混悬液通过抑制α-SMA及FN的增殖而体现出对肌成纤维细胞及成纤维细胞的抑制作用，具有明显的抗瘢痕化作用。