响应面优化酸性染料法测定走马胎总生物碱含量条件*

周泽建

(1.中央民族大学 生命与环境科学学院，北京100081;2.广西生态工程职业技术学院，广西 柳州545004)

0 引言

走马胎Ardisia gigantifolia Stapf为紫金牛科紫金牛属，是一种珍贵的民族药用植物.它具有祛风湿、活血止痛、生肌化毒、壮筋活络等功效，主要用于风湿骨痛、跌打损伤、痛经等南方常见疾病的治疗.[1]现代药理研究表明，走马胎具有抗肿瘤、抗氧化、抗血栓等生物活性.[1]走马胎的活性成分主要有多糖、三萜皂苷类、生物碱.[2]定量测定生物碱的含量有很多种方法，如滴定法、[3]酸性染料法、[4]薄层色谱分析法、[5-7]高效液相色谱分析法、[8]酶联免疫分析法、[9]仪器联用分析法、[10]高效毛细管电泳分析法[11]及近红外光谱分析法.[12]其中，酸性染料法具有简单易操作、结果可靠、重复性好等优点，被广泛应用于总生物碱含量的测定.相关文献研究结果表明，影响酸性染料法的因素主要有酸性染料用量、酸性染料p H值、静置时间.[2，13-15]因此，本研究对酸性染料用量、酸性染料p H值、静置时间进行考察，考察其对生物碱吸光度值的影响，在单因素实验的基础上，采用响应面优化酸性染料法的测定条件，为走马胎质量控制方法提供参考.

1 材料与方法

1.1 实验材料

走马胎采自广西生态工程职业技术学院温室大棚，洗净、晾干后，在60℃下烘干至恒重，粉碎，过200目筛子备用.

1.2 实验试剂

无水乙醇、硫酸、碳酸钠、氢氧化钠、磷酸二氢钾、溴甲酚绿、氯仿均为国产分析纯;氧化苦参碱对照品(编号：GR0837)购自南京广润生物制品有限公司.

1.3 实验仪器

AUW-D型电子分析天平(日本岛津);IKA旋转蒸发仪(德国IKA公司);恒温水浴锅(常州仪器制造公司);低温冷冻超速离心机(日本日立公司);紫外可见光分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司).

1.4 实验方法

1.4.1 走马胎总生物碱提取液的制备

精密称取走马胎2 g，加20倍90%乙醇，加热回流提取2 h，过滤得滤液，经旋转蒸发仪浓缩成浸膏.浸膏用2%硫酸溶解，合并酸水溶液，离心得上清液.上清液以5 mol.L-1氢氧化钠溶液调节p H值至9～10，等体积氯仿萃取三次.合并萃取液，浓缩至10 ml，备用.

1.4.2 试剂的配制

准确称取氧化苦参碱对照品7.3 mg，用无水乙醇溶解后定容至50 ml，配成0.146 mg.ml-1标准溶液，存4℃冰箱备用;精密称取磷酸二氢钾6.8045 g和氢氧化钠1.6880 g，溶于超纯水后定容至1000 ml，配成p H值大约等于7.6的磷酸缓冲液.准确称取溴甲酚绿0.1000 g，用磷酸缓冲液超声溶解后定容至200 ml，配成酸性染料溶液.

1.4.3 测定方法

精密吸取氧化苦参碱标准溶液0.6 ml，挥干后加入适量、适宜的p H值酸性染料，振摇1 min，然后加入氯仿10 ml置于分液漏斗中，振摇1 min后静置适当的时间，取氯仿层加入0.2 g的无水硫酸钠，同时以试剂作为空白，于400 nm处测定其的吸光度值.

1.4.4 显色条件的单因素实验

影响酸性染料法测定总生物碱的主要因素有酸性染料用量、酸性染料p H值、静置时间等.因此，本文采用单因素实验，分别考察此3个因素对走马胎总生物碱测定的影响.吸光度值按1.4.3测定.

1.4.5 响应面实验设计

基于单因素实验结果，根据Box-Behnken Design(BBD)设计原理，选取酸性染料用量、酸性染料p H值、萃取时间作为三个因素变量，对此三个因素进行三因素三水平响应面设计，以吸光值为响应值，各因素的三水平用-1、0、1进行编码，[16]如表1.

1.4.6 精密度实验

精密吸取供试样品溶液0.8 ml 5份，按照1.4.5得出的最优条件进行显色实验，于400 nm处测定吸光度值.计算其结果的RSD值.

1.4.7 稳定性实验

精密吸取供试样品溶液0.8 ml，按照响应面优化的显色条件进行显色实验，于400 nm处测定吸光度值.每隔0.5 h测定1次，共测5次.计算其结果的RSD值.

1.4.8 重复性实验

精确称取同一批走马胎2.00 g 5份，按照1.4.1制备供试样品溶液.采用响应面优化的显色条件，按照1.4.3法测定供试样品溶液的吸光度.计算其结果的RSD值.

1.4.9 标准曲线的绘制

依次精密吸取氧化苦参碱标准溶液0.10 ml、0.20 ml、0.40 ml、0.60 ml、0.80 ml、1.00 ml，挥干后采用响应面优化的显色条件，按照1.4.3法测定标准品溶液的吸光度.以吸光度为纵坐标，标准品溶液中氧化苦参碱含量为横坐标进行标准曲线的绘制.

1.4.10 样品测定与加标回收实验

从1.4.1制备的备用液精确量取0.40 ml 11份，前5份不加氧化苦参碱标准溶液，其余6份加标准溶液0.20 ml，挥干后采用响应面优化的显色条件，按照1.4.3法测定溶液的吸光度.计算其回收率.

表1 响应面设计水平与编码Tab.1 Independent variables and their levels used in the response surface design

1.5 数据处理

实验数据经Excel预处理后，运用Design-Expert 7.0软件进行方差分析，采用SPSS 19.0软件进行描述性统计分析.

2 结果与分析

2.1 测定波长的确定

在300～500 nm之间，对样品和对照品溶液进行光谱扫描.扫描结果如图1所示，样品和对照品溶液都在400 nm处有最大吸收峰.因此，选择400 nm为测定波长.

图1 光谱扫描图Fig.1 UV-visible spectrum chromagrams

2.2 单因素实验

2.2.1 酸性染料用量对吸光度的影响

由图2中C可以看出，除了酸性染料用量5 ml外，随着其用量的增加，样品吸光度逐渐增大，在用量为7 ml处达到最大，此后逐渐减少.因此，选择酸性染料用量7 ml为最佳比色条件.

2.2.2 p H值对吸光度的影响

样品吸光度随着p H值的增大而增大，在p H=7.6时达到最大(图2中B).因此，p H值确定为7.6左右.

2.2.3 静置时间对吸光度的影响

图2 三种因素对吸光度的影响Fig.2 Effect of acid dosage，p H and standing time on sample's absorbance

由图2中A得出，随着静置时间的增加，样品吸光度出现先增加后减少的现象，在静置时间为1.5 h处出现峰值.因此，静置时间定为1.5 h左右.

2.3 响应面实验结果分析

2.3.1 模型的建立与检验

以吸光度为响应值，采用Design-Expert 7.0软件对表2结果进行ANOVA分析，得出结果如表3所示.对表3所示的系数进行多元化拟合回归，得回归方程如下：

表2 走马胎生物碱响应面设计与实验结果Tab.2 Response surface design matrix with experimental and predicted values of total alkaloid content of Ardisia gigantifolia Stapf

表3 回归方程的方差分析表Tab.3 ANOVA for response surface quadratic model analysis of variance table

所得模型具有极显著(p＜0.01)，相关系数R2为0.9717，调整相关系数R2adj为0.9208，变异系数CV＜10%，并且模型失拟不显著(p＞0.05)(表3).这些数据充分证明该模型显著，所获得的二次回归方程在酸性染料法测定走马胎生物碱过程中拟合较好，能充分说明走马胎生物碱测定过程，因而可以利用该模型进行后续的优化设计.由表3可以得出：一次项A、C具有极显著性(p＜0.01);交互项AC和二次项C2具有显著性(p＜0.05).综合三种因素的F值，可以得出影响测定走马胎生物碱因素的重要性大小顺序为C＞A＞B，即缓冲液p H值＞静置时间＞酸性染料用量.

2.3.2 显色条件的优化

以响应值最大值为目的，运用Design-Expert 7.0软件对模型参数进行优化，得出最佳测定走马胎生物碱条件：静置时间2 h;酸性用量6.93 ml;缓冲液p H=7.20.据此优化条件测定走马胎生物碱，吸光度值可以达到0.449.酸性染料用量对模型不存在显著影响，结合实践可操作性，可以把酸性染料用量修正为7.00 ml.按照此修正条件，进行5次平行试验.试验结果如下：0.445、0.427、0.440、0.459、0.449，平均值为0.444，RSD为2.70%.该平行试验所测得的平均值0.444与模型理论值0.449相差不大，没有达到显著性水平.说明该实验方法重现性，精密度较好，所选的测定条件较为理想，可以作为酸性染料法测定走马胎生物碱的显色条件.

2.3.3 稳定性实验结果

显色测第一次吸光值后，每隔0.5 h测1次，共测6次.所测得的6次吸光值依次为：0.461、0.453、0.443、0.443、0.443、0.438，平均值为0.447，RSD为1.89%.这些数据充分证明供试样品溶液显色后的吸光度值在2.5 h之内基本稳定，可满足基本的测定要求.

2.3.4 重复性实验结果

按照响应面优化的条件进行显色后，同批次的5份走马胎样品溶液的吸光度值为0.457、0.434、0.434、0.462、0.446、0.438，平均值为0.445，RSD为2.70%.说明酸性染料法在此优化显色条件下重现性较好，所得的数据可靠.

2.3.5 标准曲线的绘制

由图3可知，标准溶液中生物碱含量在0.0146～0.146 mg之间与吸光度存在较好线性关系，线性方程为y=4.8462x+0.016，相关系数R2=0.9994.

图3 标准曲线Fig.3 Standard curve

2.3.6 样品的测定和加标回收实验

由表4，5份空白样品溶液(不加入标准溶液)含生物碱的量为0.0650 mg、0.0639 mg、0.0620 mg、0.0592 mg、0.0638 mg，平均值为0.0628 mg，RSD值为3.66%，说明该法在优化的显色条件下测定走马胎生物碱含量可行，精密度较好.6份加标溶液的回收率为97.99%、91.27%、102.30%、93.75%、95.16%、99.89%，平均值为96.73%，RSD值为3.66%.这些数据充分体现了酸性染料法在响应面优化的条件下测定走马胎生物碱含量是可行、可靠，准确度高.

表4 样品和回收率试验结果Tab.4 The result of recovery test and Ardisia gigantifolia Stapf's determination

3 结论与讨论

该实验基于单因素实验结果，利用Box-Behnken Design(BBD)试验设计方法优化显色条件，得出最佳实验测定条件如下：静置时间为2 h;酸性用量7 ml;缓冲液p H=7.20.在此条件下测定同批次走马胎生物碱含量准确度高，平均加标回收率为97.99%，相对标准偏差为4.23%.该法简单易操作、迅速、低成本、准确度较高，适用于走马胎总生物碱的测定，同时也适合一般生物碱的测定.

其他中药材总生物碱的测定条件(静置时间、缓冲液p H值)和本实验所优选出的条件相异，[17-19]这可能是没有考虑各因素之间的交互作用所致.由表3可知，静置时间与缓冲液p H值存在显著性交互作用.因此，本实验利用响应面优选的测定条件是可行、可靠的，适用于一般总生物碱的测定.