Beclin1、p62和Ki-67在乳腺浸润性导管癌患者中的表达及意义

程新宇 周成美 孙洁 王露雪 王翠芳

(1沈阳医学院附属中心医院病理科，辽宁 沈阳 110024；2锦州医科大学)

自噬是细胞在生理状态下适应环境的一种保护机制，自噬异常参与了肿瘤的发生、发展病理过程〔1〕。自噬相关蛋白(Beclin)1和自噬底物蛋白(p62)是自噬相关基因。Beclin1可与磷脂酰肌醇-3-激酶(PIK3C3或Vps34)形成自噬体，在调节自噬活性参与肿瘤发生发展中起重要作用〔2〕。p62是C-Myc编码的一种多功能泛素化结合蛋白〔3〕，具有选择性自噬功能，在一定程度上反映了自噬活性〔4〕；近年来随着研究的不断深入，研究者发现p62参与了自噬在内的众多生命活动信号通路〔5〕，其表达和调控异常与多种恶性肿瘤密切相关〔6〕，增殖指数(Ki-67)是细胞增殖的重要标志，常可作为预测恶性肿瘤发展及预后的指标。本文旨在探讨乳腺浸润性导管癌(IDC)及癌旁组织中Beclin1、p62和Ki-67表达差异及其与患者临床病理特征的关系。

1 资料与方法

1.1临床资料 选取2016年1月至2017年12月沈阳医学院附属中心医院病理科79例IDC标本为观察组，20例相应距肿瘤组织5 cm以上的癌旁正常乳腺组织标本为对照组，所有患者临床病理资料存档完整。年龄30～78岁，中位年龄58岁；肿瘤直径≤2 cm 26例，肿瘤直径>2 cm 53例；组织学分级Ⅰ级2例，Ⅱ级54例，Ⅲ级23例；有淋巴结转移33例。所有患者经免疫组织化学检测时未经放化疗。

1.2试剂 通用型Beclin1和p62鼠抗人单克隆抗体购自美国Abcam 公司；Ki-67即用型鼠抗人单克隆抗体、链霉菌抗生素蛋白-过氧化物酶链接法(SP)试剂盒及二氨基联苯胺(DAB)均购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.3SP法免疫组织化学染色 所有IDC患者肿物切除后使用10%的中性甲醛溶液固定，依据病理规定规范取材，石蜡包埋，4 μm连续切片，常规石蜡脱水，柠檬酸抗原(pH6.0)高压修复，室温冷却30 min；用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)，pH7.4冲洗3次，每次3 min，用油笔圈定玻片上的待测组织区域；每张切片均按SP法操作流程制作(其中第一抗体Beclin1或p62稀释比为1∶200；第一抗体Ki-67为即用型，均4℃冰箱冷藏过夜)；DAB显色，镜下观察后自来水冲洗，苏木素复染，PBS或自来水冲洗反蓝，梯度酒精脱水，二甲苯透明后，中性树胶封固。使用PBS代替一抗作阴性对照，用已知阳性乳腺癌标本切片作阳性对照。

1.4结果判读 所有免疫组化切片由两位经验丰富的病理科医师采用双盲法单独判读。Beclin1和p62阳性结果判读标准：阳性表达为细胞质出现棕黄色颗粒。Ki-67阳性判断标准：阳性表达定位于细胞核。在高倍镜下任意计数5个视野，每次选取200个细胞进行观察，按阳性细胞所占百分比计分，评分标准为〔7〕:0分为无阳性细胞；1分为阳性细胞<10%；2分为阳性细胞占10%～30%；3分为阳性细胞>30%。按染色强度计分：不着色为0分；淡黄色计1分；黄色计2分；棕黄色计3分。阳性细胞百分比计分与染色强度计分的乘积≤2分为阴性，>2分为阳性。

1.5统计学分析 采用SPSS17.0软件进行χ2检验、Spearman 等级相关分析。

2 结 果

2.1Beclin1、p62和Ki-67在IDC组织中表达 实验组Beclin1阳性表达位于细胞质，呈棕红色，阳性表达率〔44.3%(35/79)〕明显低于对照组〔100%(20/20)，χ2=4.803,P=0.028〕；p62阳性表达位于细胞质，呈棕黄色，阳性表达率〔58.2%(46/79)〕明显高于对照组〔10.0%(2/20)，χ2=6.532,P=0.011〕；实验组Ki-67阳性表达位于细胞核，呈棕红色，阳性表达率〔51.8%(41/79)〕明显高于对照组〔5.0%(1/20)，χ2=7.389,P=0.007〕，见图1。

2.2实验组Beclin1、p62及Ki-67表达与临床病理特征的关系 Beclin1、p62阳性表达在不同组织学分级、淋巴结转移的IDC患者中差异有统计学意义(P<0.05)；Ki-67阳性表达在不同组织学分级的IDC患者中差异有统计学意义(P<0.001)。见表1。

图1 IDC患者Beclin1、 p62、Ki67的表达(SP法，×100)

2.3实验组Beclin1、 p62和Ki-67相关性分析 Beclin1和p62共同阳性表达14例，共同阴性表达12例，呈负相关(r=-0.330,P<0.01)；Beclin1和Ki-67共同阳性表达10例，共同阴性表达13例,呈负相关(r=-0.416,P<0.01)例；p62和Ki-67共同阳性表达30例，共同阴性表达22例，呈正相关(r=0.315,P<0.01)。

3 讨 论

自噬相关蛋白表达失调可能是一种新的肿瘤发生机制〔8〕。Beclin1基因是哺乳动物中第一个被确认的自噬调控基因，在自噬过程中Beclin1能结合激活Vps34，形成Vps34-Beclin1复合体，对自噬泡的形成起关键调控作用，而Beclin1缺乏则严重影响自噬泡的形成〔9〕。Beclin1高表达能抑制肿瘤发展，失活则促进肿瘤发生〔10〕。本研究结果显示Beclin1蛋白在IDC表达较癌旁正常乳腺组织明显减低；且随着组织学分级增加及淋巴结的转移而Beclin1表达较少，提示自噬活性减低可能与IDC发生、发展有关。自噬相关蛋白p62是一种支架蛋白。自噬发生时，p62首先与细胞质中泛素化蛋白结合，再与定位于自噬体内膜上微管相关蛋白轻链3(LC3B)形成复合物，被自噬溶酶体降解。自噬过程中，p62蛋白在细胞质中不断被降解，自噬被抑制时，p62蛋白在细胞质中不断积累，因此p62可作为反映自噬活性的标记蛋白。雷程等〔11〕研究表明，p62蛋白在结肠癌组织细胞质中阳性表达明显高于癌旁正常组织，p62高表达提示自噬活动减弱，促进肿瘤发展。刘婷婷等〔12〕研究发现p62在外阴鳞状细胞癌的细胞质中表达明显高于外阴正常皮肤，说明外阴鳞状细胞癌自噬活动减弱促进了癌发生，与本实验结果一致。本研究中p62异常聚集表明IDC自噬活性显著减弱，自身受损、变性或衰老细胞器和大分子物质得不到及时降解，导致活性氧大量产生，使乳腺正常组织DNA损伤，促使正常乳腺组织向IDC进一步转化。

以往研究提示细胞内p62异常聚集能激活雷帕霉素靶蛋白(mTOR)癌基因信号〔13〕，反向调节自噬，起到促癌作用；近年来发现细胞内p62异常聚集，还可以激活核因子(NF)-κB和NF相关因子(Nrf)2两个系统〔14〕。p62蛋白通过T6BD与肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAF)6相互作用促进TRAF6的寡聚化，从而导致TRAF6的多聚泛素化及NF-κB活化〔15〕，NF-κB是一个转录因子蛋白家族，涉及细胞存活及分化，NF-κB信号途径的激活对肿瘤细胞增殖及转移非常重要；Nrf2是细胞内最重要的抗氧化应激调控通路稳定细胞内环境〔16〕。当氧化应急持续存在时，p62与Nrf2竞争结合肿瘤抑制因子(Keapl)，使Nrf2入核，从而激活Nrf2靶基因转录，此时激活Nrf2保护了肿瘤细胞免受氧化性损伤使癌细胞生存能力增强。本研究表明p62表达与肿瘤的恶性行为相关，其高表达预示IDC恶性程度高，易发生转移，是预后差的指标。Burdelski等〔17〕使用免疫组化技术检测了前列腺癌组织中p62的表达，发现其表达与组织学分级及淋巴结转移有关，与本实验结果相似。

Ki-67是一种与细胞增殖密切相关的核抗原，是评价恶性肿瘤细胞增殖程度最可靠的指标。本研究提示肿瘤细胞增殖活跃，侵袭力强，易发生转移，预后较差。

本研究提示随着肿瘤恶性程度增加自噬相关基因表达异常，细胞增殖更加活跃促进了肿瘤发生，且Beclin1和p62 与淋巴结转移相关，提示自噬相关基因表达异常能够预示IDC侵袭力强，易发生转移，预后差，自噬相关基因是判断IDC预后的又一有效指标。