慢性家族性良性天疱疮五家系ATP2C1基因突变分析

王 霆 崔红宙 王德彤 高 杰 郭书萍

慢性家族性良性天疱疮，又名Hailey-Hailey病(Hailey-Hailey disease，HHD，OMIM 169600)，是以皮肤褶皱部位反复出现水疱、糜烂为主要特征的常染色体显性遗传性皮肤病[1]。组织病理上以基底层上方棘层松解形成裂隙和水疱为特征。本研究前期收集到典型的HHD 5家系，通过Sanger测序对家系成员进行ATP2C1基因序列检测，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 对象 本研究选取来自不同家系的12例患者，最小发病年龄21岁，最大69岁，先证者经我科临床及病理组织检查，确诊为HHD,患者皮损见图1a～1e,家系图见图2a～2e。患者签署知情同意书并收集病史资料及外周血。同时选取13名表型正常的不同家系成员和100名健康对照，签署知情同意书，该研究通过医院伦理委员会审查。

1.2 方法

1.2.1 提取基因组DNA 采集HHD家系中患者及家系内表型正常者的外周静脉血5 mL，存储于2% EDTA抗凝管中，-80℃保存。使用QIA amp DNA blood mini kit(QIAGEN公司，德国)提取基因组DNA，同时以100名与该家系无亲缘关系的健康个体作为对照。

1.2.2 PCR扩增 引物序列设计参考文献[2]，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s,64℃退火30s，72℃延伸50s，前12循环退火温度每循环降0.5℃，以58℃为退火温度24个循环，72℃延伸10min。

1.2.3 DNA测序 PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后，交与上海生工生物技术服务有限公司行Sanger测序，测序结果使用Chromas软件解读，并与人类基因组数据库ATP2C1基因序列进行对比。

1a：家系1先证者腹股沟、阴囊红斑基础上糜烂、浸渍、裂隙；1b：家系2先证者腋下红斑、浸渍；1c：家系3先证者腋下红斑、浸渍；1d：家系4先证者腹股沟红斑、浸渍；1e：家系5先证者双侧腹股沟、外阴弥漫潮红色斑、糜烂、浸渍

图1先证者临床表现

2a～2e分别为家系1～5家系图(标“↑”者为先证者；标“+”者为行ATP2C1基因突变检测)

2 结果

家系1中3例患者在 ATP2C1基因第18号外显子上发现错义突变c.1738A>G(p.I580V)(图3a)，使用Polyphen-2软件进行蛋白功能预测，预测结果为possibly damaging (score=0.722)。在表型正常的3名家系成员中未发现该突变；家系2中2例患者在第25号外显子上发现无义突变c.2416C>T(p.R806*)(图3b)，2名表型正常的家系成员中未发现该突变。家系3中3例患者在第15号外显子上发现错义突变c.1250G>A(p.R417K)(图3c)，使用Polyphen-2软件进行蛋白功能预测，预测结果为benign(score=0.100)，同时家系内2名表型正常的个体未发现该突变。这些突变在100名无亲缘关系的正常人中均未发现。家系4、家系5 ATP2C1基因未发现突变。

3 讨论

HHD由Hailey兄弟于1939年首次报道并因此得名。该病呈世界性分布，发病率约为1∶50000，男女发病率大致相同，约70%患者有家族史[1]。该病的临床表现为皮肤褶皱部位反复出现水疱、糜烂，常伴不同程度瘙痒，夏重冬轻。目前尚无有效治疗手段。

1995年，Richard等[2]利用微卫星多态性标记对6个来自德国和意大利的家系行基因连锁分析将HHD致病基因定位于3q21～q24。2000年，Sudbrak和Hu等[3,4]在3q21～q24区域内发现ATP2C1为HHD致病基因。ATP2C1基因包含28个外显子，全长约107.46kb，编码949个氨基酸。截至目前，已发现140余种突变，其中中国汉族人群突变已超过80种[5,6]，突变方式包括错义突变、剪切位点突变、无义突变、移码突变及其他方式突变，这些突变散在分布于各个外显子，目前尚无明确的热点突变。人类ATP2C1基因与小鼠SPLA基因和酵母PMR1基因同源[7]，均为编码高尔基体介导的钙泵[8]。该基因的最终翻译产物为人高尔基体分泌途径Ca2+/Mn2+ATP酶(hSPCA1)。hSPCA1蛋白在人体多个组织中均表达，其中在角质形成细胞和肾脏内高度表达。这种钙泵可将胞浆内钙离子主动运输至高尔基体内，维持高尔基体内高钙离子浓度和胞浆内低钙浓度，使角质形成细胞对胞外钙离子浓度的变化反应敏感[9]。

图33a：ATP2C1基因第18号外显子c.1738A>G；3b：ATP2C1基因第25号外显子c.2416C>T；3c：ATP2C1基因第15号外显子c.1250G>A

本研究中发现的c.1738A>G、c.2416C>T、c.1250G>A所编码氨基酸分别位于跨膜片段4、5之间的胞质区和跨膜片段7、8之间的腔道区，我们推测，当胞质区和腔道区发生突变时，必然会影响hSPCA1结构的改变，从而影响其在钙离子或锰离子转运和存储功能，导致细胞内信号转导异常，无法维持高尔基体内钙离子浓度，使其对胞外钙离子变化敏感性降低，从而导致其削弱某些重要蛋白质的糖基化、水解、折叠及转运过程，特别是桥粒糖蛋白、桥斑蛋白的磷酸化和肌动蛋白的合成障碍，最终破坏细胞间黏附[10]。关于家系4、5未发现ATP2C1基因未发现基因突变的原因分析如下：(1)常规PCR扩增、电泳和测序无法检出ATP2C1基因大片段乃至于整个片段的缺失；(2)由于引物设计着重考虑外显子区域而忽略影响剪切、mRNA稳定性及蛋白翻译的内含子、转录的非编码区及启动子区域。

目前大量有关ATP2C1基因突变已陆续被发现，本研究发现的c.1738A>G、c.2416C>T曾于2002年被Dobson-Stone等[10]报道，c.1250G>A曾于2012年在汉族人群中被Zhang等[11]报道。c.2416C>T则是在我国汉族种群首次被报道。对病例进行基因型-表型关联性研究可以促进对基因诊断和精准医疗的发展，下一步我们准备收集更大的样本量，完善中国汉族人群基因型数据库；同时对基因型-表型关联性研究可以更好地指导基因诊断，为HHD患者的精准治疗提供理论基础。