黑果枸杞离体快繁技术研究

王聪慧　王铁军　高芳　秦彩云　陈士刚　才巨锋　陶晶

摘要：【目的】探讨黑果枸杞的组织培养技术，为实现规模化高效离体快繁提供技术依据。【方法】以黑果枸杞当年生嫩茎为外植体，研究激素组合对黑果枸杞组培苗初代、增殖以及生根培养的影响。【结果】适合黑果枸杞初代培养的培养基为MS + 6-BA1.0 mg/L + NAA0.2 mg/L ，腋芽生长良好，萌芽率达88.61%，且玻璃化情况较少;适合微枝增殖培养的培养基为MS + 6-BA0.1mg/L + NAA0.2mg/L，微枝生长速度快，增殖倍数可达4.8倍，少见玻璃化现象，且苗生长健壮，叶片嫩绿;适合微枝生根的培养基为1/2MS + IBA0.2mg/·L，生根率达98%。适宜的移栽基质为营养土∶河沙∶蛭石=3∶1∶1（体积比）。【结论】黑果枸杞嫩茎离体培养和茎芽增殖可以获得再生植株实现离体快繁，本研究结果为黑果枸杞优良种质规模化繁殖提供了技术支持。

关键词：黑枸杞;组织培养;增殖培养;生根培养

中图分类号：S567.19文献标识码：A文章编号：1006-8023（2019）02-0032-05

Micropropagation of Lycium ruthenicum Murr

WANG Conghui 1， WANG Tiejun 2， GAO Fang 1， QIN Caiyun 1， CHEN Shigang 1， CAI Jufeng 1， TAO Jing 1*

（1. Jilin Provincial Academy of Forestry Sciences， Changchun 130033; 2. Jilin Dunhua Forestry Bureau， Yanbian 133700）

Abstract：[Objective] To develop tissue culture technique for theLycium ruthenicum ， and provide technical basis for large scale and efficient in vitro rapid propagation. [Method] In this study， using tender stem ofL. ruthenicumas explant， the effects of different factors on primary culture， subculture and rooting culture were studied. [Results] The results showed that： the suitable medium for axillary bud sprouting was MS + 6-BA1.0mg·L -1 + NAA0.2mg·L -1， in which the axillary bud germination rate reached 88.61% and the vitrification were rarely. The suitable medium for proliferation was MS + 6-BA 0.1mg·L -1 + NAA0.2mg·L -1， in which the plantlets grew quickly. The proliferation rate was 4.8 times， and there was no vitrification with robust seedling. The suitable medium for plantlet rooting was MS + IBA0.2mg·L -1， in which the rooting rate reached 98%. Suitable transplanting substrates were nutritional soil ： river sand ： vermiculite = 2：1：1. [Conclusion] The in vitro culture and stem bud subculture ofLycium ruthenicumcan be used to obtain the in vitro rapid propagation of the regenerated plants. The results provide technical support for the large-scale propagation of the fine germplasm ofLycium ruthenicum.

Keywords： Lycium ruthenicum ; tissue culture; multiplication culture; rooting culture

0引言

黑果枸杞（ Lycium ruthenicumMurr.）為茄科（Solanceae）枸杞属（ LyciumL.）灌木 [1]。可适应盐碱荒地和盐化沙地生存，是我国荒漠区特有的抗盐抗旱野生植物，同时具有很高的经济价值及营养价值 [2-3]。其果实含有17种氨基酸 [4]，13种微量元素，具有较高的营养价值和药用价值 [5-8]，被誉为“软黄金” [9-10]。

由于具有较高的价值，大量的黑果枸杞野生资源被采集，导致野生资源难以自我恢复，分布迅速面积减小 [11-12]。黑果枸杞的扦插技术较为成熟 [11-13]，但扦插技术繁殖周期比较长。尽管黑果枸杞离体快繁技术具有一定的进展 [14-15]，但距离规模化快速繁殖还有一定距离。本研究旨在研究黑果枸杞腋芽增生途径的离体快繁技术，为规模化繁殖苗木提供技术支持。

1材料与方法

1.1试验材料与方法

1.1.1外植体消毒方法

供试材料为宁夏黑果枸杞当年生嫩枝。将当年生嫩枝去除叶片，用洗涤剂水冲洗15 min，再用自来水冲洗1～2 h 后剪成2～3 cm 长茎段（每块茎段带1～2个腋芽），置于超净工作台中，先用75%的乙醇溶液中浸泡15～20 s后，用无菌水洗净3～5次，再放入10%次氯酸钙溶液中消毒15 min，用无菌水冲洗3～5次，用灭菌后的滤纸吸干茎段表面水分待用。

1.1.2初代培养

将消毒后的黑果枸杞嫩枝分别接种于MS培养基中，培养基内含6-BA（0.5、1.0、1.5 mg/L）、NAA（0.1、0.2、0.3 mg/L）。培養基内均附加蔗糖20 g/L和琼脂5.5 g/L，高温高压灭菌前将pH调节至5.75～5.80之间。每瓶接种5个外植体，每处理20个瓶，35 d后统计其生长情况。培养室温度23 ℃，初代培养与增殖培养时光强度为1 000～1 600 lx，生根和移栽培养时光照强度为1 600～2 000 lx，每天光照培养16 h，暗培养8 h。

1.1.3增殖培养

选取初代培养长势良好的组培苗，以MS为基本培养基，培养基内含6-BA（0.1、0.2、0.4 mg/L）、NAA（0.1、0.2、0.4 mg/L）。其他条件同1.1.2，35 d 后统计试验结果。

1.1.4试管内生根培养

选取长势良好的组培苗用于生根培养试验，将增殖培养后的健壮小苗截成2.5 cm长茎段接种在含有IBA（0.05、0.1、0.2 mg/L）的1/2MS培养基上，培养基内均附加蔗糖20 g/L、NAA0.2 mg/L 和琼脂5.5 g/L，高温高压灭菌前将pH调节至5.75～5.80之间。每瓶接种5个外植体，每处理20个瓶，15 d统计其生根率及根数。

1.1.5组培苗移栽

在培养室内打开培养瓶瓶口炼苗2～4 d，选取生根状况良好的植株移栽于营养钵内，移栽前洗净小苗上沾有的培养基，用0.1%多菌灵浸泡根系，营养钵内培养基质为营养土∶河沙∶蛭石（体积比）=3∶1∶1。基质使用前需要121 ℃ 高温高压灭菌20 min，移栽前0.1%多菌灵喷洒基质，移栽后用保鲜膜遮盖置于23 ℃自然光培养7 d ，然后置于1 600～2 000 lx光照强度下培养， 10 d后统计成活率。

1.2数据统计与分析方法

试验数据用Excel 2003进行统计，根据所得数据计算平均值、增殖率等;利用SPSS 19对数据结果进行方差分析等。

2结果与分析

2.1黑果枸杞嫩芽的初代培养

不同浓度的 6-BA 和 NAA 组合，对腋芽的萌发影响差异显著（表1）。当6-BA浓度较低时，整体呈现发育缓慢和长势弱的现象，当6-BA浓度较高时，整体呈现玻璃化现象。初代培养时，腋芽在MS + 6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L上第7天开始萌动，生长状况良好，腋芽呈嫩绿色，基本无玻璃化现象，25 d后萌发率可达88.61%，显著高于其他组合。

2.2黑果枸杞嫩芽的增殖培养

不同浓度NAA与6-BA组合对增殖倍数的影响差异显著（表2）。当6-BA浓度升高到0.2 mg/L时，开始出现玻璃化现象，如图1（a）所示。当NAA和6-BA 浓度均较低时组培苗表现出长势弱和叶片发黄的现象，如图1（b）所示。在6-BA和NAA的9个组合中，较适合组培苗增殖培养的培养基为：MS + 6-BA 0.1mg/L + NAA0.2mg/L，在该培养条件下可使黑枸杞组培苗增殖培养达到最佳效果，如图1（c）所示。

2.3IBA对黑果枸组培苗生根影响

把增殖培养得到的微枝接种到生根培养基上，7 d 后，开始生根。15 d 后大量生根。不同处理的平均生根率之间差异显著（表3）。随着IBA浓度的增加，组培苗的生根率及生根数量呈增加趋势，且根系的生长状况逐渐变好。当IBA浓度为0.05 mg/L时生根率较低，如图2（a）所示。当IBA浓度为0.2 mg/L时，黑枸杞组培苗的生根培养效果最佳，如图2（b）（c）所示，生根率达98%，生根数也最多。

2.4组培苗移栽

黑果枸杞组培苗在营养土∶河沙∶蛭石（体积比）= 2∶1∶1的基质中成活率最高（93%左右），新生根丰富，该基质为适宜培养基质。

3讨论

黑果枸杞组培苗在生长过程中易出现玻璃化现象，据文献报道很多种植物的组织培养过程中都存在玻璃化问题 [14-17]。黑果枸杞的玻璃化问题的原因可能是前期培养条件不适引起的，且部分处理激素浓度不适导致。适合黑果枸杞初代培养的培养基为MS + 6-BA1.0 mg/L + NAA0.2 mg/L，萌芽率达88.61%，且玻璃化情况较少。

植物生长调节物质是组织培养中重要的组成部分，其浓度和比例是组织培养是否成功的关键因素之一。在本研究中适合组培苗增殖培养的培养基为MS + 6-BA0.1mg/L + NAA0.2mg/L，组培苗生长速度快，增殖倍数可达4.8倍，基本无玻璃化现象，且苗生长健壮，叶片嫩绿。

IBA广泛应用于生根培养过程中，本研究中，进行黑果枸杞生根试验时，在1/2MS 培养基中， IBA浓度为0.2mg/L时，黑枸杞组培苗达到适宜的生长状态，即培养基配为1/2MS + IBA 0.2mg/L，在该培养条件下，组培苗生根率高达98%，根数为8.1，且根系粗壮，基本无愈伤组织。这与生长素的机理有关系，适宜浓度的IBA能够促进根的分化。

4结论

适合黑果枸杞初代培养的培养基为MS + 6-BA1.0 mg/L + NAA0.2 mg/L，腋芽生长良好，萌芽率达88.61 %，且玻璃化情况较少;适合组培苗增殖培养的培养基为MS + 6-BA 0.1mg/L + NAA0.2mg/L，组培苗生长速度快，增殖倍数可达4.8倍，基本无玻璃化现象，且苗生长健壮，叶片嫩绿;适合组培苗生根的培养基为1/2MS + IBA0.2mg/L，生根率达98%。适宜黑果枸杞的移栽基质为营养土∶河沙∶蛭石（体积比）=3∶1∶1。本研究建立了黑果枸杞高效的离体快繁技术，为规模化繁殖提供技术支持。

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