甲苯胺蓝介导的光动力疗法对一种白腐菌的抑制

于洪枫　牟洪波　戚大伟　俞莹

摘要：木材是我国可持续发展战略的重要部分，木材腐朽是破坏木材质量的主要途径之一，白腐菌是多种木腐菌中破坏木材细胞壁最为严重的。为抑制病原菌，提高木材利用率，利用低毒、低污染的甲苯胺蓝（TB）介导的光动力疗法对白腐菌抑制作用进行研究。通过牛津杯法测试不同浓度的TB（0.01、0.02、0.05 mg/mL）作用于白腐菌时，没有观察到抑菌作用。当采用低功率的630nm激光激发TB时，发现三组浓度光敏剂TB对白腐菌均起到抑制作用，随TB浓度增加抑菌率分别为69.67%、91.21%、99.44%。实验结果表明：甲苯胺蓝介导的光动力疗法对白腐菌具有较好的抑菌效果，且光敏剂浓度与其抑菌效果呈现正相关性，体现了良好的木材防腐效果。

关键词：光动力疗法;白腐菌;甲苯胺蓝;低功率激光光源

中图分类号：Q6-33;S763.15文献标识码：A文章编号：1006-8023（2019）02-0050-05

Effect of Toluidine Blue-mediated Photodynamic Therapy on White-rot Fungi

YU Hongfeng， MU Hongbo， QI Dawei， YU Ying

（College of Science， Northeast Forestry University， Harbin 150040）

Abstract：As an important part of Chinas sustainable development strategy， woods quality is mainly destroyed by wood decay. White-rot fungus is the most serious damage to wood cell wall in various wood rot fungi. In this paper， the inhibition of white-rot fungi was studied by using low toxicity and low pollution toluidine blue （TB） mediated photodynamic therapy to inhibit pathogenic bacteria， improve wood utilization. When the different concentrations （0.01， 0.02， 0.05 mg/mL） of TB were applied to white-rot fungi by the Oxford Cup method， no bacteriostatic effect was observed. However， when TB was excited by low-power 630nm laser， it was found that the three groups of photosensitizer TB inhibited white-rot fungi， and the inhibition rates with TB concentration were 69.67%， 91.21%， and 99.44%， respectively. The experimental results show that toluidine blue-mediated photodynamic therapy has a good antibacterial effect on white-rot fungi， and the concentration of photosensitizer is positively correlated with its antibacterial effect， which reflects the good anti-corrosion effect of wood.

Keywords：Photodynamic therapy; white-rot fungus; toluidine blue; low power laser light source

0引言

與世界多国相比，我国森林资源匮乏，木材防护水平相对落后，木材的用量又多，导致我国森林面积和质量都呈大幅度下降趋势，对现有森林资源的保护变得尤为重要 [1]。在影响木材质量的众多方面中，由木腐真菌引起的木材的腐朽问题最为常见。白腐菌是木腐菌中对木材腐朽比较严重的，它能够分泌木质素降解酶，具有较强的木质素降解能力 [2-3]。目前木材防腐主要以化学药剂为主，但这些包含砷、铬或铜的水溶性防腐剂对人类和自然环境都有较大的危害 [4]。因此，研究找到对人类和环境友好的木材防腐方法和木材防腐剂是十分必要的。

光动力疗法（Photodynamic therapy简称PDT）是一种潜在的抑菌治疗方法，它将激发光和光敏剂结合在一起，分子氧存在的情况下产生包括单线态氧 [5]。单线态氧可以促进细胞中几个重要成分的损伤，如DNA、蛋白质和脂质，导致细胞死亡 [6-8]。

甲苯胺蓝（Toluidine blue 简称TB ）是一种阳离子苯噻嗪染料。TB作为一种光敏剂具有低毒性、良好的选择性和光化学性等性能，是一种很不错的抑菌治疗剂 [9-10]。

近年来，国内在木材防腐研究多集中于低毒，低污染的新型木材防腐剂的研发。2015年程康华等研究表明：己唑醇及其衍生物对木材腐朽菌有较好的抑制作用 [11]。2017年胡生辉等研究表明樟树水提取物对木材腐朽菌、霉菌的生长有明显的抑制作用 [4]。目前国内在木材防腐方面已经取得了不错的进展，但仍存在防腐工艺复杂、无法做到工业量化生产等不确定性问题。鉴于以上木材防腐现状，本文以木腐菌中的白腐菌为研究对象，将光动力疗法用于木材防腐，找到一种低污染、低毒的防腐剂甲苯胺蓝，提出了一种物理与化学防腐方法相结合的新型木材防腐方法。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1白腐菌的采集与筛选

于2016-2017年，从大兴安岭五营保护区的红松林，在活立木上采集具有生命活力的木材腐朽菌的子实体，经简单的无菌处理后装袋备用。利用组织分离方法 [12]经过多次的分离与纯化，将分离的菌种接种在固体培养基上，当平板布满菌丝且无杂菌时，即成功完成木腐菌的分离和筛选。对平板中的菌落进行愈创木酚的显色反应得知该菌种属于白腐菌，通过形态学观察法初步确定该菌种属于白腐菌中的层孔菌属 [13]。

1.1.2培养基

培养基：马铃薯洗净去皮，称取200 g，加入蒸馏水中煮烂，无菌纱布过滤，滤液中加入蒸馏水至1000 ml，加入20 g葡萄糖，琼脂20 g高温高压灭菌20 min左右后取出锥形瓶，冷却后在4 ℃冰箱贮存备用。

斜面培养基：取未完全冷却的培养液15 ml加入到试管内，将试管倾斜15°摆放，待培养基冷却凝固，放置在4℃冰箱内贮存备用 [14]。

1.1.3光敏剂和光源

光敏剂TB（阿拉丁，上海）分别以0.01、0.02、0.05 mg/ml的浓度对白腐菌进行敏化。生理溶液（0.9%氯化钠NaCl）中溶解光敏剂TB并通过0.22 μm无菌微孔膜过滤，制备出三种浓度的光敏剂溶液，光敏剂溶液贮存在黑暗条件下备用。

光源为可调红光激光器，波长为630 nm，输出功率为0.65 mW，辐射面积约为0.78 cm 2，能量密度为0.83 mW/cm 2。

1.2方法

1.2.1光敏剂抑菌性的测定

从培养箱内取出布满菌丝的的斜面培养基，在超净工作台内，取5 ml无菌水加入到斜面培养基，利用灭菌的接种针将白腐菌轻轻刮下，将含有白腐菌的溶液移入到装有玻璃珠三角瓶内，密封后在水浴恒温震荡器（SHA-C，江苏金坛亿通电子）内震荡10 min，直至菌丝均匀的分布在溶液内。

采用牛津杯法测定TB的抑菌性，在超净工作台内，用移液枪吸取1 ml孢子悬菌液滴加到马铃薯葡萄糖琼脂培养基内，用涂布器将孢子悬菌液均匀的涂布在平板表面，取4个灭菌的牛津杯（内径6 mm、外径7.8 mm、高10 mm）放置在培养基表面。以0.5 ml的无菌水（空白对照）和0.01、0.02、0.05 mg/ml的光敏剂滴至牛津杯內，封口膜封口后将平板在28±2 ℃黑暗的条件下培养30 d后观察抑菌效果 [15-16]。

1.2.2激发光源的测定

为了测定光敏剂激发光源的波长，利用光谱光度法搭建的光路图，如图1所示。

实验中首先测量了超纯水中甲苯胺蓝的吸收光谱，以超纯水作为参照，分别测量了0.01、0.02、0.05 mg/ml三种浓度甲苯胺蓝的吸收光谱，根据Beer-Lambert Law计算，利用originPro 9.0软件处理实验数据，得出不同浓度TB的吸收光谱。

A =lg（1/ T）=Kba。 （1）

式中： A为吸光度;T为透射比;K 为摩尔吸光系数，它与吸收物质的性质及入射光的波长 λ 有关; a 为吸光物质的浓度，mol/L; b 为吸收层厚度，cm。

1.2.3甲苯胺蓝的光敏性测定

为了验证TB具有良好的光敏性，是一种较好的抗菌化治疗抑制剂，采用光谱光度法对TB的光敏性进行验证。实验中以氘灯为光源，630 nm红光半导体激光器作为激发光源，AMDA（9，10-蒽基-双亚甲基二丙二酸，C22H18O8）作为单态氧指示剂 [17]。本实验中：样品为AMDA饱和水溶液、0.02 mg/ml的光敏剂TB;取3 ml AMDA饱和水溶液和1 ml 0.0 2 mg/ml的TB水溶液装在容量为 4 ml边长为 1 cm 的石英比色皿中，并从侧面用功率密度为 0.36 mW/cm 2的630 nm 激光照射。根据Beer-Lambert Law计算，每隔三分钟记录AMDA的吸收光谱，根据AMDA吸收光谱随时间变化的规律，进行线性拟合，计算出AMDA的消耗速率，AMDA消耗速率的大小反应了TB的光敏性强弱。

1.2.4菌内光敏化作用

不同浓度TB菌内敏化实验分为以下四组实验组：L+P+有光敏剂的情况下进行激光照射（ n =10 min）;L+P-仅供激光照射（ n =10 min）;L-P+仅用光敏剂处理（ n =10 min）;L-P-无激光辐射和光敏剂（ n =10 min）。根据实验组的描述，在超净工作台内用移液枪将1 ml的白腐菌菌悬浮液滴加至含有15 ml的液体培养基的玻璃试管内，在涡旋震荡器中震动5 min，使白腐菌均匀的分布在液体培养基内。将0.01、0.02、0.05 mg/ml三种浓度的光敏剂分为三组实验，每组实验内分为四小组实验，其中L+P+、L-P+组分别加入1 ml光敏剂甲苯胺蓝溶液，L+P-、L-P-组分别加入1 ml生理溶液作为对照组。每小组含有5个样本液体培养基，每组中的样本液体培养基均在涡旋震荡器中振动5 min直至光敏剂均匀分布在液体培养基内 [9]。

分别对每组中L+P+和L+P-组按照描述的方法进行辐照。在室温条件下，辐照是在黑暗条件下进行的，防止外界光线对实验造成干扰。辐照后，将液体培养基在（28±2℃，黑暗）培养30 d。采用菌丝体鲜重称重法比较白腐菌在液体培养基内的菌丝的生物量，通过平均值和标准差对称量结果进行分析。

实验结束后，将菌样从液体培养基内取出，对每组中的菌样称量（精确至0.000 1 g）得出光敏剂TB对白腐菌的抑菌率 L 。

L=T1-T2T1×100% 。（2）

式中： T 1为L-P-组菌样的鲜重质量平均数，g; T 2为L+P+组菌样的鲜重质量平均数，g。

2结果与分析

2.1白腐菌的鉴定

用0.1 mol/L的愈创木酚的乙醇溶液滴定菌落边缘，过一段时间后滴定区域变成浅粉红色。为了从形态学方法上鉴定分离筛选出的木腐真菌，拍摄的木腐真菌菌落形态如图2所示。菌丝体在培养基上向四周蔓延生长，菌落为白色，具有蘑菇气味，形状是疏松的，质地为毡状，菌落5～6周内扩展到整个平皿菌落生长过程中出现放射纹，随着菌落的蔓延生长中心区域变黄。图3为40倍Leica光学显微镜下观察得到，菌丝由硬壁包裹的管状结构，菌丝顶端呈现圆锥状，可延伸生长。菌丝生长方式为分支生长，形态上菌丝较粗且无色，为无隔菌丝，且无孢子产生 [18]。根据《中国真菌志》，从传统形态学初步鉴定该菌属于白腐菌中的层孔菌属。

2.2抑菌能力测定

为了测定无光辐射条件下光敏剂TB对该白腐菌的抑菌能力，采用牛津杯法测定。在无激光辐谢下将不同浓度光敏剂TB处理的平板培养30d后如图4所示，A、B、C和D分别代表对照组无菌水、0.01、0.02和0.05 mg/ml TB，四组牛津杯均未出现明显的抑菌圈。结果表明，TB在无激光辐射的条件下对白腐菌未出现抑制作用，且改变浓度大小也无抑菌现象。

2.3光源的选取

为了选取TB合适的激发光源，对不同浓度的TB采用光谱光度法测得吸收光谱法测，如图5所示，由图5可知0.01、0.02、0.05 mg/ml三种浓度TB的最强吸收峰中心分别位于628、629、629 nm处。因此，激发光敏剂TB的激发光源选择630 nm波段的红光作为激发光源，且这一波段的激发光源价格相对比较便宜。此外，具有长波长的激发光源对组织有更强的组织穿透性，能更好的达到组织内部促进光化学反应的发生。这意味着TB作为光敏剂在抗菌化治疗方面有更大的发展前景。

2.4光敏性的测定

TB和 AMDA 混合液的吸收光谱每 3 min 记录一次，由于实验过程中光敏剂浓度保持不变，减掉光敏剂吸收后 AMDA 吸收光谱随时间变化，如图6所示。对AMDA不同时间点的吸收光谱进行面积积分，结果见表1，A代表每个时间点AMDA的吸收光谱的面积积分值，A0代表0 min时刻的面积积分值。对实验数据进行线性拟合，得到AMDA浓度随时间变化的吸收光谱，如图7所示。由图7可知，单态氧指示剂AMDA浓度的随时间变化呈现e指数变化规律。线性拟合误差是由实验过程中氘灯光源不稳定、光纤和光路在实验过程中有微小的震动导致的。

2.5TB对菌丝抑菌效果测定

不同浓度光敏剂TB分别对白腐菌进行光敏化，光敏化作用后在人工培养箱内培养30 d，对各组中菌丝鲜重进行称量（精确至0.000 1g），每组中白腐菌菌丝的生长鲜重量结果如图8所示。结果表明，光敏剂TB介导的PDT对白腐菌有较好的抑制作用。在三组浓度TB对白腐菌光敏化实验中，每组中的L+P-组的白腐菌的鲜重质量值都低于L-P-组的值，高于L+P+组的值。结果表明，经激光单独照射木材腐朽菌中的白腐菌也有一定的抑菌作用，但差异不显著。此外，每组中的L-P-的值和L-P+的值，在不同浓度的光敏剂TB作用下，得到的白腐菌鲜重的量值都相近，说明单独使用光敏剂敏化对白腐菌没有抑制作用，与前文TB抑菌实验结论相符。

通过抑菌率公式计算可知，0.01、0.02、0.05 mg/ml组中的L+P+组的抑菌率分别为69.67%、91.21%、99.44%。由抑菌率可知，在低功率的激发光辐射下，随着光敏剂的浓度增加，对该种白腐菌的抑制效果越强。

3结论

本文通过从木腐真菌的子实体中分离与纯化得到一种真菌，经形态学鉴定该菌属于白腐菌中的层孔菌属。选取低污染、低毒性的苯噻嗪染料甲苯胺蓝（TB）作为抑菌剂，通过牛津杯法验证TB自身对该种白腐菌没有明显的抑菌效果。但通过对菌丝敏化实验发现，在低功率的630 nm激光器的辐射条件下，光敏剂TB介导的PDT对木材腐朽菌中的该种白腐菌有良好的抑菌效果，且随着光敏剂浓度的增大抑菌效果增加。通过体外对TB光敏性测试，TB具有良好的光化学性能，是一种具有很大发展前景的光敏剂。

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