硫磺和放线菌强化植物修复土壤镉污染

张子杨,郭瞻宇,管伟豆,郭 堤,李荣华,张增强



硫磺和放线菌强化植物修复土壤镉污染

张子杨,郭瞻宇,管伟豆,郭 堤,李荣华,张增强*

(西北农林科技大学资源环境学院,陕西 杨凌 712100)

为了强化耐受重金属镉(Cd)的植物包心芥菜对土壤中Cd污染的富集及转运效率,以包心芥菜为研究对象,向土壤中添加0.3%的硫磺和接种不同数量的放线菌Act12(0.5,1.0,1.5,2.0g/kg),通过盆栽实验,研究不同处理间根际土pH值的变化规律、包心芥菜地上和地下部分Cd的积累量、植物抗氧化酶系的变化以及根系活力.结果表明:添加0.3%硫磺和2.0g/kg放线菌Act12后,根际土pH值下降最大,相比对照下降了14.5%.而添加0.3%硫磺和1.5g/kg的放线菌Act12,包心芥菜地上部分Cd的含量最高,转运系数最大,相比对照,Cd含量提高了79%,并且植物地上部分的干重最大.添加放线菌Act12对植物的抗氧化系统有积极作用,CAT、POD、SOD含量均在0.3%硫磺和1.0g/kg放线菌Act12的添加组合下达到峰值,放线菌Act12还可提高植物的根系活力,降低丙二醛的含量.综上表明,添加硫磺和放线菌Act12均可强化包心芥菜吸收土壤中Cd的能力,其中0.3%硫磺和1.5g/kg放线菌Act12的添加组合强化效果最佳.

镉；放线菌Act12；硫磺；包心芥菜；抗氧化酶；转运；富集

近年来,我国工业含镉(Cd)“三废”大量排放[1],通过扩散、沉降、积累的方式造成了较大面积农田土壤受不同程度的Cd污染[2].2014年《全国土壤污染状况调查公报》中显示,Cd污染点位超标率为7.0%,在无机污染物中最高[3].因此,农用地Cd污染的安全利用和生态修复至关重要.国家生态环境部在2014年发布的污染场地土壤修复技术中针对土壤重金属污染推荐了8种治理措施,其中植物修复是利用耐受并能积累重金属的植物吸收土壤环境中的重金属离子,将它们输送并贮存在植物体的地上部分.植物修复具有成本低、不破坏土壤生态环境、不引起二次污染等优点,被大规模的应用在土壤重金属污染修复中[4-6].但是单纯的使用超富集植物修复也有自身的局限性[7],如植物的生物量小、生境独特等,使得在运用超富集植物修复时受到很大的限制[8-9].而一些生物量大,生长迅速的普通植物又达不到超富集植物的积累效果.但是,将一些生物量大,生长迅速的耐受植物进行强化来修复土壤的Cd污染效果显著.强化的途径包括提高土壤中Cd的有效态含量和促进植物根系的生长.Valentinuzzi等[10]研究了接AM菌小麦和正常小麦根际Cu、Pb、Zn和Cd的形态分布,结果表明,AM菌可通过改变根际中重金属的形态来改变重金属的生物有效性,降低重金属的毒性.Sun等[11]研究发现,从污染土壤中分离具有Cu特异性的菌株,主要是厚壁菌、放线菌和变形菌等,其主要的优势菌株为芽孢杆菌,这些菌株不仅能促进油菜植株的生长,使根部和地上组织干重分别增加132%~155%和71%~83%,还能促进植株对Cu的吸收,使植物地上组织中Cu含量增加63%~ 125%.微生物可以通过自身的胞外沉淀、胞内积累和络合作用,吸收土壤中的重金属[12-13],降低重金属浓度;还可以通过微生物在污染土壤中的积极作用,提高植物对土壤重金属的吸收和转移效率[14].硫磺加入土壤中,通过土壤中氧化硫微生物的作用,硫磺被氧化,降低了土壤pH值,活化了土壤中的重金属.

因此,本文以对Cd有较强耐受性的包心芥菜[15]为研究对象,添加硫磺和接种不同数量的放线菌Act12,以期探究出一种强化包心芥菜吸收土壤中Cd的方法,为土壤Cd污染场地的植物修复提供理论依据和技术支撑.

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试土壤采集于陕西省宝鸡市凤县某铅锌冶炼厂(33°56'N,106°32'E)附近耕作农田0~20cm的耕作层土壤.将采集到的土壤在自然条件下风干后,用镊子去除土壤中的动植物残体和较大块的石头,过2mm孔径的尼龙筛网,备用.同时取一定量土壤,过0.15,0.25mm孔径的尼龙筛,用于土壤理化性质分析(0.25mm)及重金属Cd含量测定(0.15mm),测定方法见《土壤农化分析》[16],该土壤理化性质如下:pH值为8.31,有机质含量为1.35%,碱解氮含量为60.23mg/kg,速效磷含量为296.46mg/kg,速效钾含量为296.46mg/kg,全量镉为10.5mg/kg,DTPA-Cd含量为1.137mg/kg,土壤含水率为17.56%.本次试验用土中重金属Cd的含量超出了《土壤环境质量农用地土壤污染风险管控标准(试行)(GB15618-2018)》的限值,供试土壤全量Cd为10.5mg/kg,而标准中Cd的农用地土壤污染风险管制值为3.0mg/kg (6.5< pH£7.5),超出了管制值,原则上应当采取严格的管控措施.

供试包心芥菜种子购自国内某种子公司,该种子是由广州市农业科学院蔬菜研究所育成.品种发芽率³85.0%,纯度³95.0%,净度³98.0%.在种植前先用0.5%NaClO室温下消毒15min,再用蒸馏水反复冲洗,洗净后用纸擦干,均匀的撒在花盆内,在种子上覆盖一层约0.5cm厚的土.

供试微生物为密旋链霉菌(, Act12),是放线菌的一种,由西北农林科技大学提供.该菌是从青藏高原、黄土高原土壤极端生境下的近万株微生物中分离筛得到的,具有促进植物生长、固氮、抗旱等功能.

供试硫磺为升华硫(分析纯AR),分子式为S,分子量为32.07,购自阿拉丁试剂公司.

1.2 试验设计

本实验于2018年3月底~6月初在西北农林科技大学资源环境学院科研旱棚中进行.选用塑料花盆,该花盆的直径为24cm,高度为22cm.为了在收获时便于收集植物的根际土以及花盆底部的漏水,装土前给花盆套两层塑料袋.每盆装土3kg(风干土),装土高度约20cm.本次试验共有10个处理,各个处理的设置见表1.H2组中所有处理都添加了0.3%的硫磺,放线菌Act12的浓度设置与H1组相同.装土时取3kg(以干重计)过2mm孔径尼龙筛的土壤装入塑料花盆中.然后根据各个处理间的要求,定量的向花盆中加入硫磺和放线菌Act12,并且将其与供试用土完全混合.将混合好的土壤每天定量的浇水培养7d.7d后包心芥菜种子用0.5%NaClO消毒15min,然后用去离子水冲洗干净后,挑选籽粒饱满的包心芥菜种子播种,每盆播种30粒,待植株生长至3片真叶间苗至5株,种植期间要定期浇水(2次/d),使盆栽中的水量保持在田间持水率的75%.每个处理重复3次.在种植期间,定期的更换每个盆栽的位置,使得每个盆栽的光照均匀且充足.种植50d后,选取3株植物,各选部位、长势、叶龄一致的有代表性的叶子,测定分析抗氧化酶活性.在种植第60d收获.收获时,用枝剪沿着土壤的表面,将包心芥菜的地上部分剪去,然后用自来水冲去泥污,再用去离子水冲洗干净,擦干放进信封.地下部分收获时,先将根系周围0~2cm的根际土收集到自封袋中,在自然条件下进行风干;将包心芥菜的根系用自来水冲洗干净,再用EDTA-2Na浸泡植株根系30min,以去除根系表面的可交换态Cd,最后经去离子水完全冲洗后用吸水纸擦干,装入信封.

表1 盆栽实验处理

1.3 指标测定

根际土pH值测定方法:植物根际是指生物和物理特性受到植物根系影响的紧密环绕根部的区域,这个区域的土壤称为根际土.称取2.00g过0.15mm尼龙筛的根际土(植物根系周围4cm周围的土壤),加入20mL的去离子水(水土比为1:10)后振荡30min,取出静置30min后用DELTA320pH计测定.用105℃烘干称重法进行芥菜生物量测定.参照《土壤农化分析》将包心芥菜植株粉碎后,称取0.15g置于微波消解管中,用HNO3-H2O2微波消解后,定容,过滤,然后利用火焰原子吸收分光光度计(Hitachi Z-3000,日本)进行Cd含量测定.同时以国家标准物质(GSB 04-1721-2004,GBW 08502)进行质量控制,所有植物样品的Cd回收率均大于95%.包心芥菜植株的丙二醛(MDA)含量测定采用硫代巴比妥酸(TBA)在酸性条件下加热与组织中的丙二醛发生显色反应,生成红棕色的三甲川,分别在532,600,450nm 波长处测定其吸光度的方法[17].过氧化氢酶(CAT)活性测定采用试剂盒-比色法,试剂盒购买于南京建成生物工程研究所.过氧化物酶(POD)活性测定采用愈创木酚法[18].超氧化物歧化物酶(SOD)采用氮蓝四唑显色法[19].各个处理包心芥菜的富集系数(BCF)、转运系数(TF)的计算公式如下:

BCF=植株地下部分Cd含量/土壤Cd量 (1)

TF=植株地上部Cd含量/植株地下部分Cd含量 (2)

1.4 数据处理

数据处理使用Microsoft Excel 2016,Origin 2016软件进行绘图,数据统计分析采用SPSS19.0 (IBM,USA)软件,用Duncan法做差异显著性检验,在<0.05水平(表示差异达显著性水平)下进行分析.

2 结果讨论

2.1 硫磺与放线菌Act12对植物根际土pH值的影响

表2 盆栽实验期间根际土pH值的变化

注:同列不同小写字母表示在<0.05水平上差异性显著,下同.

硫磺是一种还原态的单质硫,在土壤中容易被微生物氧化,生成硫酸盐,变成了可以被植物根系吸收利用的养分[20].硫磺被氧化的同时伴随着H+的释放,可使土壤的pH值降低[21].植物根际土的pH值降低,活化了根际土中的Cd,使Cd的有效态含量升高,植物可吸收的Cd含量增加[22].并且硫磺在土壤中的氧化过程主要是微生物学的过程,多数土壤以硫杆菌和某些异养微生物为主来氧化硫磺[23].在盆栽实验的进行过程中,每隔10d对所有盆栽的pH值进行监测.由表2可看出,经过60d的种植,各个处理的植物根际土pH值相对于第0d均有小幅减小,降幅为4.03%~12.4%,但个别未达到显著水平(>0.05).对于加入放线菌Act12的处理中,植物根际土的pH值随着时间的推移而降低,并且放线菌Act12的施入量越大,到60d时,植物根际土的pH值越小.其中处理SA4在60d的pH值最低,pH值为7.02,与对照CK相比降低了14.5%(<0.05).这说明接入放线菌Act12后,可以在硫磺的基础上,再次降低土壤的pH值.这主要是因为Act12在生长繁殖的过程中,释放出一定量的有机酸[24],而这些有机酸使土壤的pH值降低[25].这也和土壤中的有机质增加有关.添加有机物质能显著促进硫磺的氧化速率,使氧化速率提高14.3%~540.4%.因此,放线菌Act12的加入,使盆栽中的有机物质增加,提高硫磺氧化的速率.

2.2 硫磺和放线菌Act12对植物地上和地下部分生物量的影响

由表3可知,加入硫磺的H2组(S、SA1、SA2、SA3、SA4)和未加入硫磺的H1组(CK、A1、A2、A3、A4)相比,植物的地上部分的干重平均值有所减少.这是因为加入硫磺后,可以在短时间内降低土壤的pH值,对种子的初期萌发产生不利的影响,在种子出芽时,加入硫磺处理的植物发黄,而不加硫磺处理的植物正常.随着放线菌Act12浓度的增加,H1、H2组植物地上部分干重均呈先增加后减少的变化趋势.这可能是由于过多重金属的胁迫会导致微生物的产铁细胞减少有效态铁离子的释放,从而抑制了植物的生长[26].其中处理SA4相比较处理S,地上部分的干重增加了33.83%(<0.05).而其余处理(SA1、SA2、SA3)与处理S相比,干重有所增加,但未到达显著水平(>0.05).这说明包心芥菜为Cd的耐受植物,在其浓度范围内,放线菌Act12的加入,可以促进包心芥菜地上部分的生长.这是由于微生物在生长过程中通过产酸及溶磷作用,增加了有效磷的含量,促进了植物的生长发育[27],所以加入了放线菌Act12会增加植物地上部分的干重.Ali等[28]对重金属胁迫情况下的高粱加入放线菌Act12的研究中,与本文结果一致.Dary等[29]和Jia等[30]在对Zn、Pb、Cd胁迫下的黄羽扇豆和黑麦草加入微生物群落的研究中也有与本文相似的结果.

对于包心芥菜的地下部分而言,加入0.3%的硫磺也会对包心芥菜的根系生长产生一定的影响.随着放线菌Act12浓度的增加,地下部分的干重也随之增加.在SA4处理中,根的干重最大(1.35g),比对照增加了63.2%(<0.05).曹书苗等[31]对Pb胁迫下的黑麦草中加入Act12后,根的鲜重最大增加了94.6%(<0.05).放线菌在生长过程中,在植物的根际中可能会产生如抗生素、有机酸、氨基酸、酶等代谢产物,这些物质本身可刺激植物根系发育及养分吸收.并且放线菌Act12可以改善根际土中的微生态平衡,趋利避害,使得有益微生物繁殖.Ali等[32]将放线菌Act12施入受Cd胁迫的印度芥菜根际土的研究中,印度芥菜的地上和地下部分的干重都有所增加.因此,加入放线菌Act12可以增加包心芥菜地上和地下部分的生物量[33].

表3 施入硫磺和放线菌Act12各个处理的植物地上、地下部分干重

2.3 植物地上和地下部分重金属Cd的含量

植物体内Cd含量是筛选植物修复资源的重要指标之一.由表4可知,加入0.3%硫磺与未加入硫磺的处理相比,地上部分重金属Cd的含量明显增加.加入0.3%的硫磺可以促进包心芥菜的地上部分吸收更多的重金属Cd,这主要是因为硫磺对土壤中的Cd有活化作用,土壤中Cd的有效性显著增加.湛润生等[34]与本文的研究结果相同.SA1、SA2、SA3、SA4处理与CK相比,植物地上部分的积累量都有显著的提升(<0.05).这表明硫磺和放线菌Act12共同施用可以促进包心芥菜富集土壤中的重金属Cd.其中,SA3处理的积累量最大,积累量达到了34.93mg/ kg,相比较CK提高了79%(<0.05),并且植物生长茂盛,叶片翠绿,茎秆粗壮.这表明当0.3%硫磺和1.5g/kg的放线菌共同施用的情况下,包心芥菜对土壤中Cd的富集能力最强.这与郭瞻宇等[35]所筛选出的耐性芥菜品种中的研究结果一致.邹素敏等[36]对不同芥菜品种的重金属污染评价研究得出包心芥菜在食品安全范围内,可以种植;Liu等[37]对Cd胁迫下的40种白菜研究发现,耐性白菜品种对Cd的吸收能力较弱,可以作为低积累安全品种种植.本文的研究结果与之不一致,这可能是包心芥菜对Cd吸收和迁移转换的能力与其基因有一定关系.随着放线菌的浓度增加,植物地上部分的Cd含量并未随之增加,在放线菌浓度最大时(2.0g/kg),地上部分Cd积累量小于SA3处理的含量.王小敏等[38]在土培实验中也发现,在接菌超过一定量时,土壤中Cd的有效性未随之增加.

表4 Cd胁迫下包心芥菜的Cd含量、转运系数(TF)和富集系数(BCF)(均以干重计算)

Cd在植物地下部分的积累规律与地上部分的积累规律相似.富集系数反映了植物对土壤中重金属的富集能力,而转运系数反应的是重金属从地下部分迁移到地上部分的能力.由表4可知,加入0.3%硫磺后,可以将包心芥菜的转运系数提高20.1%.加入放线菌Act12的SA1、SA2、SA3、SA4处理比未加放线菌Act12的A1、A2、A3、A4处理的迁移富集能力都强.其中,SA3处理的转运系数最大,达到1.03.而SA3处理的富集系数最大,达到了3.41.随着放线菌浓度的增加,转运系数和富集系数的变化规律都是先增加后减小,但是所有处理的富集系数均大于1,说明包心芥菜对土壤中Cd的吸收能力强.但是将包心芥菜与Cd的超富集植物如龙葵,印度芥菜,东南景天相比,包心芥菜的富集系数相对较小.这可能是由于此次盆栽实验所用的土壤为陕西省凤县某铅锌厂周围的自然污染土,土壤中Cd的有效态含量低的缘故.对于转运系数,在前期的预实验中,确定了加入一定量的硫磺可以提高植物的转运系数.但是,随着放线菌浓度的增加,转运系数并未随之增加,这归因于加入过多的放线菌Act12处理的根部对Cd的固定和区隔化,使得只有少部分Cd能通过木质部导管运输到地上部分.本次盆栽实验用土的Cd含量为10mg/kg,而我国土壤Cd污染大多数为中轻度污染,因此,将硫磺和放线菌结合促进包心芥菜吸收土壤中重金属符合现阶段我国土壤重金属污染修复的需要.

2.4 硫磺与放线菌Act12对植物抗氧化酶系的影响

包心芥菜体内的CAT(过氧化氢酶)、POD(过氧化物酶)和SOD(超氧化物歧化酶)等抗氧化酶组成了一个高效的活性氧(ROS)清除系统,可以清除植物细胞内的活性氧自由基,减缓植物体遭受重金属污染的胁迫.并且这一过程是一个动态平衡的过程.它们是保证包心芥菜耐重金属胁迫的重要物质基础.首先,SOD可以将带有毒性和活性的超氧自由基转化为过氧化氢(H2O2),然后在CAT和POD的作用下,H2O2发生歧化反应,反应生成水和氧气分子.通过这3种酶之间的相互作用,维持植物体内活性氧自由基的动态平衡[39-40].根据图1,添加硫磺的H2组与未添加硫磺的H1组相比,植物的抗氧化酶(CAT、POD、SOD)均有所降低,但CAT的含量有所下降,未到达显著水平(>0.05).从植物的生长状况也可以看出:添加硫磺的盆栽叶片发黄,植株矮小.

根据图1(a),随着放线菌Act12的浓度的增加,加菌处理比不加菌对照的CAT含量都要高,其中SA2最高,比对照高出了41.9%(<0.05).随着往土壤中添加外源微生物Act12可以有效的提高植物体内CAT的含量.并且随着CAT的含量水平不断提升,对植物的抗氧化系统起着积极的作用[41].但是在SA3的时候,CAT的含量会下降,这主要是因为SA3处理植物体内的重金属含量最高,使得重金属刺激ROS所产生的CAT失活;酶的合成减少和酶组成的改变[42].

POD包含在一个多重的催化反应中,并且POD的活性随着外界重金属的胁迫而发生改变.根据图1(b),随着放线菌Act12浓度的增加,加菌处理比对照的POD含量都要高,其中SA2处理POD的含量比对照高出了19.5%(<0.05). POD一般也参与光合作用;蛋白质的形成可减少重金属对植物的毒性[43].在SA3中,POD含量明显下降(<0.05),这主要是因为包心芥菜中重金属含量过多造成的.

SOD在抗氧化系统中的主要作用是将ROS自由基转化为H2O2.本研究中,相对于不加菌的处理,加菌处理的SOD含量都高于不加菌处理的SOD含量.但是包心芥菜体内SOD活性表现出先增后降的趋势,在SA2时达到峰值,相比CK增加了12.7% (<0.05).这说明,加菌后,植物体内的SOD含量升高,从而降低了体内活性氧自由基对细胞膜的膜脂过氧化作用的伤害.

2.5 硫磺与放线菌Act12对植物根系活力和丙二醛含量的影响

通常情况下, ROS的产生与清除是一个动态平衡的过程,但当植物受到外界重金属Cd胁迫时,这一平衡受到破坏,过量ROS导致植物细胞膜系的功能和结构遭到破坏.MDA是膜脂过氧化的重要产物,植物细胞膜受害程度越高,MDA的含量越高.由图2(a)可知,H1和H2组处理下,包心芥菜根系MDA的含量均随着放线菌Act12浓度的增加,呈现出先降低后升高的趋势.在接入放线菌Act12后,降低了包心芥菜根系MDA的含量,降低幅度达到18.8%~48.3%,其中,A1相对于对照有所下降,但未达到显著水平(>0.05),其余处理相对于对照,均达到显著水平(<0.05).这说明,Cd的胁迫可以使细胞脂质过氧化,胁迫程度越大,MDA的含量越大,但是向土壤中接种放线菌Act12后可以缓解Cd对植物根系的胁迫,降低MDA的含量.这与李冬琴等[44]对Cd胁迫玉豆的抗氧化酶影响的研究结果相同.植物根系是重要的吸收和合成器官,并且直接影响地上部分的生长和对Cd的吸收.根系活力是植物根系的生理指标之一.根据图2(b)可知,加入0.3%的硫磺后,植物的根系活力与不加硫磺的处理相比有所降低.但随着放线菌Act12浓度的增加,包心芥菜的根系活力逐渐增加.这说明了放线菌Act12的加入对提高根系活力有积极作用.

3 结论

3.1 向土壤中添加硫磺可以持续的降低土壤pH值,到60d收获时,pH值最大降幅14.5%.向土壤中接种放线菌Act12后对根系和植物的生长有显著的促进作用.

3.2 包心芥菜抗氧化酶(CAT、POD、SOD)的活性随着Cd含量的增加呈下降趋势,但接种放线菌Act12后,提高了抗氧化酶的活性,清除了Cd胁迫所产生的含氧自由基,增强了包心芥菜的耐性.

3.3 硫磺添加量为0.3%,放线菌Act12的添加量为1.5g/kg时,包心芥菜的长势良好,抗氧化酶(CAT、POD、SOD)的协同作用强.并且地上部分Cd的积累量最大,说明0.3%硫磺和1.5g/kg放线菌Act12的添加模式下,包心芥菜对Cd有较好的吸收净化能力,对农田土壤Cd污染修复具有很大的潜力.

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致谢：本实验在种植盆栽过程中,得到了本实验室巴基斯坦留学生Altaf Hussain Lahori的帮助,在此表示感谢.

Combination of sulphur and actinomycete to enhance the efficiency of phytoremediation in cadmium contamination soil.

ZHANG Zi-yang, GUO Zhan-yu, GUAN Wei-dou, GUO Di, LI Rong-hua, ZHANG Zeng-qiang*

(College of Natural Resources and Environment, Northwest A & F University, Yangling 712100, China)., 2019,39(5)：2106~2114

Enhanced phytoremediation with the involvement of microbes and chemicals has become an alternative technique to remediate the contamination of heavy metal in soils. The combination of 0.3% sulfur and three levels of actinomycete Act 12 enhanced phytoremediation has been experimented to remediate the Cd-contaminated soil by employing Brassica juncea, a Cd-tolerant plant. The Cd accumulation in plant root and shoot part, antioxidant enzyme activities and plant root activity were measured to explore the potential mechanisms. The results showed that the combination of 0.3% sulfur and 2.0g/kg Act12 addition significantly reduced Rhizosphere pH by 14.5%. By comparison, the combination of 0.3% sulfur and 1.5g/kg Act12 addition treatment dramatically increased Cd accumulation in plant shoot by up to 79%. Act12 addition positively enhanced plant antioxidant system, and the values of CAT, POD, and SOD reached the peak in the treatment with a combination of 0.3% sulfur and 1.0g/kg Act12. Additionally, Act12 addition boosted plant root activities and reduced the content of MAD. Our study indicated that both sulfur and actinomycete Act 12 can enhance the absorption capacity of Cd by Brassica juncea, and the combination of 0.3% sulfur and 1.5g/kg Act12 addition achieved the best results in our experiments.

Cd；actinomycetes Act12；sulfur；Brassica juncea；antioxidant enzymes；transport；enrichment

X53

A

1000-6923(2019)05-2106-09

张子杨(1994-),男,陕西宝鸡人,西北农林科技大学硕士研究生,主要研究方向为土壤重金属污染生态修复.发表论文1篇.

2018-10-13

十三五国家重点研发计划资助专项子课题(2017YFD0801101)

*责任作者,教授,zhangzq58@126.com