全国主栽棉花品种棉籽氨基酸组分分析及质量初步评价研究

王爽，荣梦杰，金云倩，王延琴

（棉花生物学国家重点实验室/农业部棉花产品质量安全风险评估实验室/中国农业科学院棉花研究所，河南 安阳 455000）

棉花是关系国计民生的大宗农产品，既是纺织工业主要的原材料，也是我国重要的油料作物。棉花纤维是重要的纺织原料，同时伴随其生产的更多数量的棉籽因含有丰富的氨基酸、脂肪酸、维生素等成分，同样是我国食用油、食用菌、饲料、纤维素行业的重要原材料[1]。棉籽与稻米、小麦等谷类作物不同，其蛋白质成分具有良好的氨基酸组成，含有人体所需的8 种必需氨基酸，属于全价蛋白质，其含量组成接近联合国粮农组织和世界卫生组织推荐的水准[2]。另外在社会发展需求方面，近些年来随着人们生活水平的提高，对肉、蛋、奶等的需求日益增加，促进了我国畜牧业的快速发展，进而提高了畜牧养殖饲料原料的消费量，最终造成了我国畜牧业和饲料工业的迅速发展与饲料蛋白资源紧缺的矛盾日益突出。而现有的植物蛋白质资源未得到充分利用，棉籽原料多、蛋白品质高，具有巨大的利用开发潜力，为解决这一矛盾提供了一种选择路径。因此，棉籽作为一种重要的植物蛋白资源，提高棉籽蛋白质含量和改良氨基酸组成既是棉花育种的目标，也有利于棉籽产品下游的综合开发利用，对于缓解蛋白资源的紧缺现状和农业的提质增效具有十分重要的意义。

本研究采用邻苯二甲醛(OPA)和氯甲酸芴甲酯(FMOC)联合柱前衍生，基于外标法对棉籽中的氨基酸组成进行定性和定量分析。OPA 和FMOC均为氨基酸分析中的柱前衍生试剂[3]，原理是在3-巯基丙酸 （3-MPA） 存在下，一级氨基酸首先与OPA 反应，而二级氨基酸不和OPA 反应，然后再利用FMOC 进行衍生。使用Advance Bio AAA 氨基酸专用柱分离，梯度洗脱，二极管阵列检测器（DAD）检测，测定棉籽中氨基酸含量。本方法的优点在于分析时间短（18 min）、准确性好、灵敏度高和样品前处理简单[4]。

1 材料与方法

1.1 试验材料及试剂

1.1.1试验材料。2015―2016年采集于我国长江流域、 黄河流域和西北内陆三大主产棉区主栽棉花棉籽样品305 份（表1），代表了我国棉花生产的现状。

1.1.2仪器与试剂。Agilent1100 系列高效液相色谱仪, 配有真空脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器DAD。

表1 各省份采集样品数量

试剂：邻苯二甲醛、氯甲酸芴甲酯、巯基丙酮、四硼酸钠、磷酸氢二钠、浓盐酸、乙腈、甲醇、硼酸、磷酸、氢氧化钠、17 种氨基酸混合标准液。

氨基酸混合标准液的配制： 将浓度为2.5 mmol·L－1的 17 种氨基酸混合标准液稀释，配制成浓度分别为 4.5、45、225、450 和 900 μmol·L－1的混合标准溶液。

1.2 试验方法

色谱柱： 安捷伦 4.6*100 mm Advance Bio AAA 柱。

流动相 A： 称取 1.4 g 无水 Na2HPO4和 3.8 g Na2B4O7·10H2O，将其溶于 1 L 水中。用 1.2 mL 浓盐酸将pH 调节为8.2。

流动相B：乙腈∶甲醇∶水（45∶45∶10, v∶v∶v），所有流动相溶剂均为HPLC 级。

洗脱梯度：0.0～0.35 min （B:2%），0.35～13.4 min（B:2%～57%），13.4～13.5 min（B:57%～100%），13.5～15.7 min（B:100%），15.7～15.8 min（B:100%～2%），15.8～18.0 min（B:0%）。

二极管阵列（DAD）检测器：

信号A：波长 338 nm、带宽10 nm、参比波长390 nm、带宽20 nm；

信号B：波长 262 nm、带宽16 nm、参比波长324 nm、带宽8 nm。

在线自动衍生程序：从瓶1 中吸取2.5 μL（硼酸缓冲液）； 吸取 0.5 μL 样品；“在空气中” 混合 3 μL，最大速度，2 次；静置 0.5 分钟；从瓶 2 中吸取 0 μL（用未加瓶盖中的水清洗针头）；从瓶3 中吸取0.5 μL（OPA）；“在空气中”混合 3 μL，最大速度，6次；从瓶2 中吸取0 μL（用未加瓶盖中的水清洗针头）；从瓶 4 中吸取 0.5 μL（FMOC）；“在空气中”混合 4 μL，最大速度，6 次；从瓶 5 中吸取 32 μL（进样稀释剂）；“在空气中”混合 18 μL，最大速度，2 次。

氨基酸的提取： 每份样品各取0.1 g 加10 mL浓度为 6 mol·L－1的盐酸（含 0.1%苯酚），通氮气 1 min，于110℃干燥箱或恒温模块中水解22～24 h，取出冷却至室温，过滤至10 mL 容量瓶并定容，取1 mL 于试管，通氮气吹干，再加 0.1 mol·L－1的盐酸 2 mL 溶解稀释，涡旋混合，过 0.45 μm 滤膜，装瓶进样。

1.3 样品测定及分析

在相同流动相和衍生条件下，每个样品重复3次，实验结果取平均值，并采用SPSS 23.0、Origin 8.0 软件等做统计分析。

2 结果与分析

2.1 棉籽氨基酸组成的定性分析

首先，对棉籽中的氨基酸组分进行定性分析，在流速 1.0 mL·min－1、 柱温箱 40 ℃、338 nm 波长条件下检测出混合标准品中的显著的16 种氨基酸目标峰，但标准品中的脯氨酸未识别。通过色谱条件优化，在相同流速和温度时，在262 nm 检测波长下能够检出脯氨酸目标峰（图1A）。基于此种方法，我们对棉籽样品中的氨基酸组分进行识别，能够检测到17 种氨基酸成分（图1B）。需要注意的是，本方法没有进行色氨酸的检测，原因是本研究采用盐酸水解，而在氨基酸分析中，酸水解时色氨酸在110 ℃用 6 mol·L－1盐酸水解超过 24 h 会被全部破坏[5]。

2.2 棉籽总氨基酸定量分析

通过HPLC 化学工作站数据处理系统，按峰面积外标法进行定量分析，求得各氨基酸的平均含量，如表2 所示。所有样品本棉籽中总氨基酸含量在32.5%～49.5%之间，总氨基酸平均含量为40.65%，符合黄庄荣报道的棉籽氨基酸总含量范围[6]。就各氨基酸在样品间相对含量的分布来看，苏氨酸含量的变异系数远大于其他氨基酸，达到25.95%。谷氨酸、丝氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸变异系数小于10%，其余12 种氨基酸变异系数均大于10%。从各氨基酸的变异系数来看，说明本实验抽样样品离散程度大，能够代表我国棉籽中各氨基酸含量的分布情况。

图1 棉籽氨基酸混合标准品（图A）和样品（图B）的液相色谱图

表2 各省份采集样品数量

表2 （续）

按照样品地区分析，新疆、河北产地的棉籽氨基酸含量相对较集中 （取样品数量较多的五个产地），河南省氨基酸平均含量高于其他各省，这次实验样品数目最多的新疆和安徽地区总氨基酸含量没有差异，新疆地区氨基酸平均含量为400.33 mg·g－1，安徽地区氨基酸平均含量为 406.79 mg·g－1（P＞0.05）。

图2 样品数量较多的不同省份各样品氨基酸总含量

2.3 必需氨基酸分析

常见的必需氨基酸 （包括条件必需氨基酸）为赖氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、组氨酸等，棉籽中该类必需氨基酸占总氨基酸平均含量29.6%。赖氨酸作为很多植物性饲料中主要的限制氨基酸占棉籽总氨基酸含量的4.75%，与其他油料相比含量较低，为第一限制性氨基酸。所以当利用棉籽饼粕为原料配制混合饲料时，需要注意氨基酸平衡，额外添加赖氨酸进行补充。另外，赖氨酸在棉籽粕中利用率不高[7]，是由于棉籽中的棉酚会和赖氨酸中ε-氨基结合发生美拉德反应，褐变生成不溶性复合物，降低赖氨酸利用率[8]，所以有部分地区把棉籽粕用作肥料，脱毒后用于饲料[9]。甲硫氨酸在畜禽饲养中起到促进畜禽生长、增加瘦肉量的作用，棉籽中甲硫氨酸占总氨基酸含量的2.26%，但甲硫氨酸毒性较强，也不宜在饲料中添加过量[10]。

2.4 非必需氨基酸

棉籽中的非必需氨基酸为天冬氨酸、 谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、胱氨酸、脯氨酸，占棉籽总氨基酸平均含量的70.4%。其中含量最高的是谷氨酸，达到 68.27～128.04 mg·g－1，平均含量为 97.69 mg·g－1。精氨酸作为一种功能性氨基酸在棉籽中含量较高，平均含量达到59.00 mg·g－1，属于棉籽有代表性的氨基酸种类。精氨酸可控制体内细胞的退化、降低血氨和增加肌肉活力等功能，对禽畜的生长、繁殖、免疫性能都有重要作用[11]。丙氨酸在棉籽中平均含量为 18.10 mg·g－1，作为某些功能性氨基酸代谢的含氮产物，有利于内脏氮循环机制，在仔猪生长中起到增强猪免疫和生糖作用[12]。

2.5 氨基酸间的相关性分析

氨基酸处于代谢网络的各个位置，不同氨基酸之间存在着特定的相关性，棉籽中不同氨基酸间的相关性分析结果见表3。棉籽中苏氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸相对于其他氨基酸显著性系数较小，甲硫氨酸相对其他大部分氨基酸无显著相关性； 谷氨酸、酪氨酸与总氨基酸呈显著相关性，相关性系数大于0.9；精氨酸作为棉籽中的代表性氨基酸，除了与苏氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸无显著相关外，与其余氨基酸均呈显著性相关。苯丙氨酸与酪氨酸相关性系数达0.78，显著相关，这与苯丙氨酸在体内被摄取后

部分经肝脏苯丙氨酸羟化酶的作用转变为酪氨酸有一定关联。

表3 棉籽不同氨基酸间的相关系

2.6 棉籽样本基于氨基酸组成的聚类分析

对305 份棉籽的氨基酸含量构成进行分类（图3），在距离为16 处将全部样品分成五类，第Ⅰ类包括236 份棉籽，表现为精氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸含量中等；第Ⅱ类包括53 份棉籽，表现为甲硫氨酸含量中等，精氨酸、赖氨酸含量较高；第Ⅲ类包括1 份棉籽，表现为赖氨酸含量较低，精氨酸含量较高，甲硫氨酸含量中等；第Ⅳ类包括13 份棉籽，表现为精氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸含量均较低；第Ⅴ类包括2份棉籽，表现为精氨酸、甲硫氨酸含量较低，赖氨酸含量较高。第Ⅱ类的53 份棉籽氨基酸总含量较高，具有作为高品质饲料原料的潜力，但精氨酸与赖氨酸间存在拮抗作用[13]，二者的适宜比例对促进家禽生长和生产性能有重要意义，其深层次机理还有待进一步研究。

图3 305 份样品精氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、总氨基酸含量聚类分析结果

3 讨论与结论

305 份棉籽氨基酸总含量为40.65%，谷氨酸、精氨酸含量较高，苏氨酸、胱氨酸含量较低。必需氨基酸占29.6%，非必需氨基酸占70.4%。聚类分析将样品分为五类，其中第Ⅱ类的53 份棉籽表现为甲硫氨酸含量中等，精氨酸、赖氨酸含量较高，但精氨酸与赖氨酸的适宜比例及深层次机理还有待探讨。随着饲料研发技术的不断进步，棉籽作为饲料原料将有广阔的应用前景。