温度和 pH对棕黑锦蛇消化酶活性的影响

金建丽， 刘思宇，2， 刘艳爽， 曹明星

(1.牡丹江师范学院 生命科学与技术学院， 黑龙江 牡丹江 157011； 2.富锦市第四中学， 黑龙江 富锦 156100)

棕黑锦蛇(Elapheschrenckii)属脊索动物门，爬行纲，有鳞目，游蛇科，锦蛇属[1]，为我国北方常见的大型蛇种，食用价值和药用价值高，市场需求量较大，而人工养殖的棕黑锦蛇死亡率较高，难以满足市场需求，致使野生资源不断遭到滥捕，野生资源量逐渐减少。因其种群结构简单，捕获的个体越来越小，是亟须保护的对象。

消化酶是由消化道或消化腺分泌的起营养消化作用的一种特殊酶类，对于动物的生长和发育极为重要，在动物生理生化研究中，其消化酶研究是不能缺少的重要一环。酶的本质是蛋白质，决定了其酶促反应受温度和pH的影响，国内外有很多关于温度和pH对动物消化酶活性影响的报道[2-5]。目前，有关动物的消化酶研究主要集中于水产品消化酶性质的研究、外界因素对消化酶活性的影响[6-8]等，而有关蛇类消化酶的研究国内外仅有少量报道[2-3，9-10]。为此，笔者以棕黑锦蛇为研究对象，研究温度和pH对棕黑锦蛇消化酶活力的影响，以期为其消化生理研究、人工配合饲料的研制及洁净养殖生产提供参考，以实现对棕黑锦蛇的有效保护及可持续利用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 棕黑锦蛇于2014年7月采集于牡丹江东京城林业局，共15条，均为健康成年个体。样本存于超低温冰箱中待测。

1.1.2 仪器超纯水系统(上海和泰仪器有限公司)，高速分散均质机(FT-200型，上海标本模型制造)，高速冷冻离心机(Beckman64R，美国)，L3S可见分光光度计(上海仪电分析仪器有限公司)，微量移液枪(Rainin Pipetlite Magnetic Assist Pipette SL-10 SL-100，德国Eppendorf公司)，超低温冰箱(美国贝克曼公司)。

1.1.3 试剂磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、柠檬酸、巴比妥、浓盐酸、甘氨酸、氢氧化钠、酪素、可溶性淀粉、碘酸钾、碘化钾、聚乙烯醇粉末、橄榄油、甘氨酸、福林酚、95%乙醇、碳酸钠、三氯乙酸和酚酞等，均为国产分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 粗酶液制备取棕黑锦蛇食道、胃、小肠、大肠、肝脏和胰脏，用生理盐水清洗胃中食糜和肠道内容物样本。样本与磷酸缓冲液按1∶20比例于冰浴中充分匀浆，匀浆液置于高速冷冻离心机中(4℃，12 000 r/min)离心20 min，上清液即为粗酶液。

1.2.2 反应体系的pH和温度设置pH：在37℃条件下，以pH间隔0.4，在5.0～10.6范围内设置15个pH梯度(5.0、5.4、5.8、6.2、6.6、7.0、7.4、7.8、8.2、8.6、9.0、9.4、9.8、10.2、10.6)。温度：在最适pH条件下，以温度间隔3℃，在23～56℃范围内设置12个梯度(23℃、26℃、29℃、32℃、35℃、38℃、41℃、44℃、47℃、50℃、53℃、56℃)。

1.2.3 酶活力测定

1) 蛋白酶。采用福林-酚法[11]测定蛋白酶活力。蛋白酶活力以比活力表示(U/mg)，即在pH 7.5和37℃条件下，1 mg蛋白酶每分钟水解酪素产生1 μg酪氨酸为1个酶活力单位(表示所用粗酶液中每毫克酶蛋白的活力单位)。

2) 淀粉酶。采用淀粉-碘法[11]测定淀粉酶活力。淀粉酶活力以比活力表示(U/mg)，即在pH 7.5和37℃条件下，30min内，100 mL粗酶液中1 g淀粉酶能完全水解淀粉10 mg为1个酶活力单位。

3) 脂肪酶。采用聚乙烯醇橄榄油乳化液水解法[11]测定脂肪酶活力。脂肪酶活力以比活力表示(U/mg)，即在pH 7.5和40℃条件下，1 mg脂肪酶水解脂肪每分钟产生1 μmol脂肪酸的酶量为1个酶活力单位。

1.3 数据处理

用软件Origin Pro 9.0计算酶液蛋白含量及酪氨酸含量。试验数据用软件SPSS 16.0进行ANOVA单因素方差分析和Duncan多重比较进行显著性检验。

2 结果与分析

2.1 不同 pH下棕黑锦蛇的消化酶活力

2.1.1 淀粉酶从表1可知，棕黑锦蛇食道、小肠、大肠淀粉酶活力在pH 5.0～6.6时呈上升趋势，pH为6.6时最强，分别为56.72 U/mg、43.79 U/mg和67.15 U/mg；pH 7.0～10.6时酶活力呈下降趋势。胃淀粉酶活力在pH 5.0～6.2时升高，pH为6.2时最强，为137.95 U/mg；pH 6.2～10.6时酶活力呈下降趋势。肝脏淀粉酶活力在pH 5.0～7.0时逐渐上升，pH为7.0时酶活力最强，为166.61 U/mg；在7.0～10.6时酶活力逐渐下降。胰脏淀粉酶活力在pH 5.0～5.8时逐渐升高，pH为5.8时最强，为315.92 U/mg；pH 5.8～10.6时酶活力呈下降趋势。表明，棕黑锦蛇消化系统食道、胃、小肠、大肠、肝脏、胰脏中淀粉酶活力的最适pH分别是6.6、6.2、6.6、6.6、7.0和5.8。

表1 不同 pH下棕黑锦蛇消化系统的淀粉酶活力

注：同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，下同。

Note：Different lowercase letters in the same column indicate significant difference(P<0.05).The same below.

2.1.2蛋白酶从表2看出，pH对棕黑锦蛇消化系统蛋白酶活力的影响无明显规律。食道蛋白酶活力在pH 9.8时最强，为141.42 U/mg；胃蛋白酶活力在pH 6.6时最强，为132.74 U/mg；小肠蛋白酶活力在pH 9.0时最强，为199.54 U/mg；大肠蛋白酶活力在pH 8.6时最强,为105.96 U/mg；肝脏蛋白酶活力在pH 5.8时最强，为347.97 U/mg；胰脏蛋白酶活力在pH 10.2时最强，为957.38 U/mg。表明，棕黑锦蛇消化系统食道、胃、小肠、大肠、肝脏、胰脏中蛋白酶活力的最适pH分别是9.8、6.6、9.0、8.6、5.8和10.2

2.1.3 脂肪酶从表3可知，食道脂肪酶活力在pH 5.0～6.2时逐渐升高，pH 6.2时最强，为0.034 U/mg；pH 6.2～10.6时酶活力逐渐下降。胃脂肪酶活力在pH 5.4时最强，为0.036 U/mg；pH 5.4～10.6时呈下降趋势。小肠、胰脏脂肪酶活力在pH 5.8时最强，分别为0.036 U/mg和0.038 U/mg；pH 5.8～10.6时呈下降趋势。大肠脂肪酶活力在pH 5.0～6.6时逐渐升高，pH 6.6时最强，为0.035 U/mg；pH 7.0～10.6时酶活力逐渐下降。肝脏脂肪酶活力在pH 5.0～7.4时呈上升趋势，pH 7.4时最强，为0.039 U/mg；pH 7.4～10.6时酶活力逐渐下降。表明，棕黑锦蛇消化系统食道、胃、小肠、大肠、肝脏、胰脏中脂肪酶活力的最适pH分别是6.2、5.4、5.8、6.6、7.4和5.8。

2.2 不同温度下棕黑锦蛇的消化酶活性

2.2.1 淀粉酶从表4可知，棕黑锦蛇食道、胃、小肠、大肠、肝脏、胰脏淀粉酶活力分别在32℃、35℃、35℃、35℃、38℃、29℃时最强，分别为83.56 U/mg、52.45 U/mg、49.47 U/mg、35.22 U/mg、72.09 U/mg和91.68 U/mg。在最适温度条件下，6种组织中淀粉酶活力胰脏>食道>肝脏>胃>小肠>大肠，且差异显著(P<0.05)。

表2 不同 pH下棕黑锦蛇消化系统的蛋白酶活力

表3 不同 pH下棕黑锦蛇消化系统的脂肪酶活力

表4 不同温度下棕黑锦蛇消化系统的淀粉酶活力

2.2.2 蛋白酶从表5看出，棕黑锦蛇食道、胃、小肠、大肠、肝脏、胰脏蛋白酶活力分别在38℃、41℃、38℃、44℃、47℃、53℃时最强，分别为128.13 U/mg、88.70 U/mg、194.53 U/mg、84.52 U/mg、135.30 U/mg和133.54 U/mg。在最适温度条件下，6种组织中蛋白酶活力小肠>肝脏>胰脏>食道>胃>大肠，且差异显著(P<0.05)。

2.2.3 脂肪酶从表6看出，棕黑锦蛇食道、胃、小肠、大肠、肝脏、胰脏脂肪酶活力分别在38℃、47℃、38℃、35℃、41℃、44℃时最强，分别为0.27 U/mg、0.31 U/mg、0.42 U/mg、0.03 U/mg、0.51 U/mg、0.51 U/mg。在最适温度条件下，6种组织中脂肪酶活力胰脏=肝脏>小肠>胃>食道>大肠，且差异显著(P<0.05)。

表5 不同温度下棕黑锦蛇消化系统的蛋白酶活力

表6 不同温度下棕黑锦蛇消化系统的脂肪酶活力

3 讨论

3.1 pH 对棕黑锦蛇3种酶活力的影响

蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶是与动物消化作用紧密相关的酶类，对动物的消化营养及生长发育起关键作用。同种动物消化系统不同部位不同消化酶的活性具有较大差异，不同动物消化系统同一部位消化酶的活性也存在差异。pH是酶促反应过程中的重要因素之一，酶促反应均在一定pH条件下进行，pH能改变酶的活性中心或者有关基团的状态[12]。当酶处于某一特定pH环境时，其活性达到最大，即为该酶的最适pH，当低于或高于该pH值时酶活性都会下降，过酸或过碱会使酶的活性改变或丧失，酶活性随pH值变化呈倒“V”字形。

试验结果表明，棕黑锦蛇消化系统6种组织中蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活力的最适pH不同，其食道、胃、小肠、大肠、肝脏、胰脏中淀粉酶活力的最适pH分别为6.6、6.2、6.6、6.6、6.6和6.2，蛋白酶活力的最适pH分别为6.2、6.8、6.2、5.9、6.2和6.2，脂肪酶活力的最适pH分别为6.2、5.2、5.4、6.2、7.4和4.6。在pH 5.0～8.2时胰脏中淀粉酶活力较高，尤其在pH 5.8～7.8时其活力是其他组织的数倍；同时，在pH 5.0～8.2时肝脏中淀粉酶活性除在pH 6.2时低于胰脏和胃外，其余pH下仅次于胰脏、高于其余组织。表明，胰脏在淀粉的消化与吸收过程中发挥主要作用，其次为肝脏。棕黑锦蛇消化系统各组织的蛋白酶活性整体在中性偏酸性时较高，在偏酸性条件下肝脏蛋白酶活力最强，其次为胰脏，在中性和碱性条件下胰脏蛋白酶活力最强，其次为肝脏。表明，肝脏和胰脏在蛋白质的消化及吸收过程起主要作用。棕黑锦蛇消化系统各组织的脂肪酶在接近中性弱酸时活性最强，在中性偏碱条件下脂肪酶活性呈递减趋势，在试验设置的最大pH 10.6时最低，呈即将失活状态，同时在最小pH 5.0时活性也较低，与pH对酶活性影响的典型特点(倒“V”字形)相符。因此，在棕黑锦蛇养殖过程中要对饲料成分适当调整，以促进棕黑锦蛇对营养物质的消化吸收，提高饲料的能量利用率，以达到促进生长及节约成本的目的。

3.2 温度对棕黑锦蛇3种酶活力的影响

温度是影响酶促反应的重要因素之一。酶表现最大活力时的温度即为该酶的最适温度，温度过高会使酶失活，低温只会降低酶的活力而不会使酶失活。酶的最适温度也不是酶的特征常数，与底物浓度、作用时间等因素有关[12]。在动物消化系统的不同消化部位，因酸碱度和酶的种类不同其最适pH和最适温度也不同。

蛇是变温动物，其体温随环境温度变化而变化，直接影响到体内消化酶的活力。试验结果表明，温度对棕黑锦蛇消化酶活性有显著影响。食道、胃、小肠、大肠、肝脏、胰脏中淀粉酶活力的最适温度分别是32℃、35℃、35℃、35℃、38℃和29℃，蛋白酶活力的最适温度分别是38℃、41℃、38℃、44℃、47℃和53℃，脂肪酶活力的最适温度为38℃、47℃、38℃、35℃、41℃和44℃。棕黑锦蛇胃淀粉酶活力的最适温度是35℃，与虎斑颈槽蛇的研究结果一致[3]。胃、小肠、大肠淀粉酶活力的最适温度均是35℃，食道淀粉酶活力的最适温度是32℃，说明消化道内淀粉酶的功能具有一致性。同时，在试验所设温度范围内，胰脏淀粉酶的活力最强，与pH对淀粉酶活力的影响结果一致。胃、小肠中蛋白酶活力的最适温度分别为38℃和41℃，与对虎斑颈槽蛇的研究结果[3]相近。在23～41℃时小肠的蛋白酶活力最强，其次是肝脏；在44℃和47℃下肝脏的蛋白酶活力最强，在50℃及以上时胰脏的最强。在23～38℃各组织蛋白酶活力随温度增加呈上升趋势，在47～56℃随温度增加呈下降趋势。表明，温度对棕黑锦蛇消化系统各组织中蛋白酶活力的影响基本一致。在6种组织中，除大肠脂肪酶活力随温度变化波动不大外，其余组织均呈典型的倒“V”字形变化。棕黑锦蛇小肠脂肪酶活力的最适温度为35℃，与对虎斑颈槽蛇的研究结果[3]相近。除大肠外其余5种组织脂肪酶活力的最适温度都偏高，同时，从整体看，肝脏和胰脏的脂肪酶活力强于其余组织，说明肝脏和胰脏在脂肪的消化吸收方面起重要作用。

蛇类属于喜凉动物，当环境温度在40℃以上时极易死亡[13]，在离体条件下测定得到的结果表明，棕黑锦蛇部分组织个别消化酶的最适温度超过致死温度。因此，测定结果在一定程度上反映了消化酶的耐热性和适应性，可为棕黑锦蛇人工饲养的温度控制提供借鉴。

4 结论

棕黑锦蛇食道、胃、小肠、大肠、肝脏、胰脏中淀粉酶活力的最适pH分别是6.6、6.2、6.6、6.6、7.0和5.8；蛋白酶的最适pH分别是9.8、6.6、9.0、8.6、5.8和10.2；脂肪酶的最适pH分别是6.2、5.4、5.8、6.6、7.4和5.8。棕黑锦蛇食道、胃、小肠、大肠、肝脏、胰脏中淀粉酶活力的最适温度分别是32℃、35℃、35℃、35℃、38℃和29℃；蛋白酶的最适温度分别是38℃、41℃、38℃、44℃、47℃和53℃；脂肪酶的最适温度分别是38℃、47℃、38℃、35℃、41℃和44℃。

在最适pH和最适温度条件下，棕黑锦蛇食道、胃、小肠、大肠、肝脏、胰脏中淀粉酶活力胰脏>食道>肝脏>胃>小肠>大肠，且差异显著(P<0.05)；蛋白酶活力小肠>肝脏>胰脏>食道>胃>大肠，且差异显著(P<0.05)；脂肪酶活力胰脏>肝脏>小肠>胃>食道>大肠，且差异显著(P<0.05)。