悬钩子属植物的组培快繁技术研究进展

杨鼎元，张群英*，陈 哲，李永霞

（贵州省植物园，贵州贵阳 550004）

悬钩子属（Rubus L.）是蔷薇科（Rosaceae）中的一个大属[1]，在我国已记录该属植物有194种，88变种，被分为8个组，24个亚组[2]。本属植物大多果实多浆，味甜酸，可供食用，在欧美已作为重要水果[3]长期栽培；有些种类的果实、种子、根及叶可入药；茎皮、根皮可提制栲胶[4]；少数种类庭园栽培供观赏[5-6]。

我国悬钩子资源较为丰富，不断有新种被发现[7-10]，农艺性状优良的悬钩子属植物一旦驯化种植成功，往往当年挂果，生长期可达数十年，可以使种植者获得稳定的经济来源。近年来[11]，国外悬钩子属的红树莓（Rubus idaeus L.）品种秋来斯（Autumn Bliss）、那好（Navaho），黑树莓（Rubus mesogaeus） 品种萨利（Shawnee）等作为“第三代水果”被大量引入我国，产生了较高的经济价值和社会效应。但与国外对比，我国的悬钩子属植物资源，未能充分开发利用；同时国外引进的悬钩子属植物品种极易造成品种老化，退化严重[12]。因此，建立一套高效的快速繁殖体系，不但有利于新品种的开发，更是扩大本土优良品种繁殖的重要手段，也可短时间内获得大量优质组培苗以满足种植商需求。

对悬钩子属植物的组织培养技术方面的研究进行了总结和展望，并探讨了悬钩子属植物比较有价值的研究方向，旨在为将来快速繁育适合市场的优良悬钩子属品种及其优质栽培提供一定的科学依据。

1 悬钩子属植物的组培快繁技术综述

1.1 外植体选择

植物组织培养常用的材料是植物的组织和器官，但也有使用植物细胞作为初始材料的。外植体的污染和褐化是悬钩子属植物进行初代培养时必须解决的问题，选择适宜的外植体，不但可以降低污染和褐化率，也可提高成活率，为之后的继代增殖提供较多的材料。

在悬钩子属植物的组培实验中，通常选取的外植体材料是一年生带芽嫩茎（单芽茎段）[13,14]、茎尖[15]或以未萌发的腋芽作为材料[16-18,20]，王禹[19]认为带腋芽的嫩枝茎段外层包裹的芽鳞片易于剥离，可以减少污染，而且在田间易于取材，王岳英[20]的研究支持这种方法。但也有研究者[14,21]认为从茎段上剥下芽并去除芽鳞片来作为接种外植体的方法对比直接灭菌接种的方法更能提高萌发率，降低污染率。究其原因，幼嫩芽体直接接触营养物质，芽体生长点较容易吸收营养物质，从而促其萌发；而单芽茎段，接种中以茎梗接触培养基，营养物质需经茎梗运输到芽体，经切割和消毒后，茎梗运输系统势必在一定程度上受损，故芽体生长点较难吸收到营养物质，而且受消毒后变褐的鳞片束缚，故其萌发率较低[28]。

许多研究者[14-20]发现不同季节选取的同种悬钩子属植物材料的外植体在初代培养中以相同处理后接种的萌发率、污染率、褐变率各不相同，其研究结果均表明在每年4～5月进行的外植体初代培养往往具有较高萌发率，更低的污染率、褐化率，这可能是因为4、5月份悬钩子属植物处于生长旺盛期，体内激素水平较高[13]，因此萌芽率较高；6～8月份进入雨季容易造成枝条更高的污染率；9～11月份枝条木质化严重，导致褐化严重；当年12月～次年3月植株处于休眠状态，故萌发率较低[13,14,17,20]。

1.2 外植体消毒

挑选合适的悬钩子属植物外植体后，在接种前须经严格灭菌，一般步骤如下：材料除去不需要的部分，用流水冲洗→细毛刷清洗→饱和肥皂水[13]或洗洁精[14]清洗→自来水清洗→转移至超净工作台内75%酒精浸泡30S→消毒剂消毒→无菌水冲洗5遍→接种。

在悬钩子属植物组培中，常见的消毒剂有以下3种：①75%酒精：此浓度下的酒精具备较强灭菌效果，有利于其他消毒剂渗入，但对植物组织损伤较大故消毒时间不宜过长，因而不能彻底灭菌，须配合其他杀菌剂使用。②氯化汞（HgCl2）：又称升汞，有剧毒，常用0.1%浓度处理5～15min，灭菌效果较强，但残毒较大须无菌水多次冲洗，酒精加升汞的灭菌方式是悬钩子属植物组培中采用的最多的体外消毒方式。③次氯酸钠：通常采用2%～10%浓度灭菌，处理时间15～30min，灭菌效果较好，易于去除，且对植物无害，须配合酒精使用加强灭菌效果。

悬钩子属植物表面特别是茎大多披绒毛、细刺较容易在之后环节中因表面消毒不够彻底产生污染，郭玉霞[16]等在超净工作台内以灭过菌的手术刀片将绒毛细刺刮去的方法降低污染率，有研究者[20]针对这类材料采用在灭菌剂中添加数滴0.1%浓度的Tween20的方法提高外植体灭菌效果。

1.3 培养基和生长调节剂

对于悬钩子属植物，常见的 MS、MT、White、N6、B5、NT等培养基均能满足悬钩子属植物生长需要[23]，但国内外的研究者们更多地选择MS培养基，主要是因为无机盐和离子浓度较高，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其养分的数量和比例合适，能满足植物细胞的营养和生理需要，同时Poothong[24]等人发现合理增大培养悬钩子属植物CaCl2、MgSO4和KH2PO4等无机盐含量能显著促进其生长，因此，可以认为MS培养基是非常适合悬钩子属植物组培的培养基种类。

在悬钩子属植物组织培养中主要采用6-BA（苄氨基腺嘌呤）、NAA（萘乙酸）、IAA（吲哚乙酸）、6KT（N6-呋喃甲基腺嘌呤）、GA3（赤霉素）、IBA（吲哚丁酸）、C2H4（乙烯）等植物生长调节剂，但剂量在不同种类的接种材料、组培过程中的不同阶段而各不相同，如表1-3所示。

表1 在悬钩子属植物的启动培养中生长调节剂浓度配比

表2 在悬钩子属植物的增殖培养中生长调节剂浓度配比

表3 在悬钩子属植物的生根培养中生长调节剂浓度配比

在悬钩子属植物的启动培养中均使用MS培养基，由表1可知，使用最多的生长调节剂是6-BA、NAA和GA3这3种调节剂，其中所有的悬钩子属植物的启动培养都使用了6-BA，其剂量范围从0.2～1.0mg/L，在相应报道中，均取得较高的接种萌发率。

在悬钩子属植物的增殖培养中均使用MS培养基，由表2可知，使用最多的生长调节剂是6-BA和NAA这2种调节剂，悬钩子属植物的增殖培养都使用了这2种调节剂，其剂量范围从0.5～1.0mg/L（6-BA）、0.05～0.2mg/L（NAA），6-BA与NAA的剂量比例保持在1（6-BA）∶0.1（NAA），有研究者[29]采用响应面法优化红树莓组培苗增殖培养条件，其结果表明6-BA浓度在1.59mg/L时，增殖系数最高。

由表3可知，在悬钩子属植物的生根培养中均使用1/2MS培养基，使用最多的生长调节剂是NAA和IBA这 2种调节剂，其剂量范围从0.05～1.0mg/L（NAA）、0.05～1.0mg/L（IBA），一方面采用1/2MS培养基，减少营养成分，加强悬钩子属植物的自养；另一方面添加了利于根系生长的NAA、IBA等生长调节剂促进生根，其中郭玉霞[15]等人在生根培养基底部中加入活性炭吸附营养成分，进而促进生根的方法被证实相同状况下，生根培养基中添加少量活性炭能显著地促进悬钩子属植物生根。

1.4 炼苗移栽

当悬钩子属组培苗生根后，就需要对瓶内苗进行移栽前炼苗处理，因为大田环境、温室条件与组织培养的环境有很大的不同，比如光照强度、温度、空气湿度以及环境无菌到非无菌等差别。

1.4.1 介质选择及消毒。种植介质通常选用疏松透气、保水性佳易消毒灭菌的泥炭土、珍珠岩、蛭石、粗沙等。介质使用前需消毒，可用高压、曝晒、消毒剂等方法[22]。

1.4.2 炼苗。应分阶段进行，即松开组培瓶盖1～2天→开盖1～2天→完全打开盖子，最后将小苗根部培养基小心冲洗干净后再转移到营养钵内灭菌介质中。同时应注意瓶内苗因在容器内时湿度较高，转移最初几天应保持小苗周围空气湿度在90%～100%的范围内为佳，提高小苗成活率[18]。

1.4.3 注意环境条件。小苗移栽后因为由异养转变为自养，应适当加强光照强度[18,29]，约在1500～3000Lx之间，如有条件，应使整个炼苗过程的温度保持在20～25℃。

2 展望

我国悬钩子属植物资源十分丰富，近年来陆续有研究者不断从中开发出新的天然产物、膳食资源、药用活性成分[30]，如陈雪香[31]通过对悬钩子属植物山梅叶片内叶萜类和酚类物质分离、结构鉴定等以及抗肿瘤研究，发现山梅对于差异蛋白主要作用结直肠癌通路、氧化磷酸化通路、细胞周期、p53通路和Wnt等通路,在这些通路中对抑制肿瘤的发生发展具有重要的作用。李程[32]等通过对树莓组培苗未生根和生根2个时期的组培苗为材料，对其各个部位的抗氧化酶活性、总酚含量及其对DPPH自由基的清除作用进行研究，发现树莓苗具有较强的对DPPH自由基的清除能力，对于将树莓作为药食领域的开发与利用提供了理论依据。

虽然悬钩子属植物的繁殖方法简单，但目前国内栽培的悬钩子属植物品种多由国外引进,其品种来源往往不确定,故极易造成品种老化，退化严重[12]。因此建立一套高效的快速繁殖体系，不但有利于纯化国外引种品种也是扩大本土优良品种繁育时的重要手段，同时国外研究者[23]已经利用组培手段成功从受感染的悬钩子属植物中去除苹果花叶病毒和树莓丛状矮病毒，进一步展现了组织培养技术在优化植物性状方面的潜能。因此悬钩子属植物不但在产品开发上有极大研究潜力，在组培方面的研究同样具备极大的空间。