从进境草籽中截获剪股颖粒线虫的体会

王 晨

（上海东郁园林科技有限公司，上海浦东 200135）

剪股颖粒线虫（Anguina agrostis）是牧草和草坪上重要的有害生物，被我国列入检疫性有害生物名录[1]。1997年～2003年，我国口岸曾数次在进口草籽中截获该线虫，但此后10余年来我国未见有记录截获该线虫[2-4]。2017～2018年，上海口岸先后2次分别在进境草籽中截获该线虫，现将检疫过程中的体会整理如下，以期为口岸检疫部门提供技术参考。

1 截获

2018年3月，上海进口一批美国俄勒冈州细弱剪股颖（Agrostis tenuis）草种，总重11.34t。3月28日在外高桥港口采集样品并送到实验室。鉴于美国是剪股颖粒线虫的分布区，且剪股颖植物是该线虫的典型寄主，故对送检的样品进行仔细检查。经前期试验发现，采用直接挑取虫瘿法分离获得的粒线虫数量较多，故采用直接挑取虫瘿法检验该批样品。获取虫瘿后，用挑针刺破虫瘿，有大量线虫逸出。将获得的线虫采用形态学及分子相结合的方法进行鉴定，经确认该线虫是剪股颖粒线虫。

2 检测过程中的体会

2.1 加大对重点样品的检测力度

近年来，我国草籽进口量越来越大，其中禾本科草籽占多数。剪股颖粒线虫的寄主较广泛，可为害禾本科植物10多个属，其中黑麦草属（Lolium sp.）、早熟禾属（Poa spp.）、羊茅属（Festuca spp.）等草籽都是我国进口量较大的草籽[1]。据统计，美国、加拿大、丹麦、新西兰、荷兰等国是我国草种进口的主要国家，上述国家均有剪股颖粒线虫分布，应引起检疫部门高度重视[1,5]。据统计，我国口岸曾在弯叶画眉草、剪股颖、匍匐茎剪股颖（Agrostis stolonifera）、细弱剪股颖（Agrostis tenuis）中截获剪股颖粒线虫，口岸若发现这类样品应重点查验[2-4]。

2.2 线虫的分离方法

本实验室前期研究发现，对剪股颖草籽、匍匐茎剪股颖、细弱剪股颖等剪股颖属（Agrostis）草籽类样品，采用直接挑取虫瘿法分离粒线虫具有分离数量大、耗时少的优点，故对该类样品采用直接挑取虫瘿法进行分离。挑取时要注意每次选取的样品尽量少，以使样品尽量散开平铺，互相不重叠。当发现颜色较深（黑色或棕色）的杂质时（见图1），尽量都挑取出来。进一步置于解剖镜下观察。

图1 正常植物种子与虫瘿比较（箭头部位为虫瘿）

图2 解剖镜下正常植物种子与虫瘿比较（上方2粒种子为正常植物种子；下方2粒种子为虫瘿）

经观察，典型的剪股颖粒线虫草籽，头尾略尖，中间较宽，呈纺锤形；比正常的植物种子大一些（图2）。对疑似虫瘿的杂质，滴入数滴清水，稍加湿润后，采用解剖针挑破、刺破，进一步观察是否有线虫逸出。

2.3 线虫的鉴定

采用传统的形态学与分子生物学相结合的方法进行鉴定。可采用28S和ITS区通用引物扩增线虫核糖体DNA，将所得PCR产物进行测序，并进行序列比对及系统发育分析；也可参照国标中的特异引物对线虫进行PCR扩增，观察是否产生特异性条带[6]。

3 总结

近年来，我国牧草及草坪草种子进口量较大。据统计，2011～2014年，上海口岸进境种子数量达5.373万t，其中禾本科种子占绝大多数，占总量的92.87%。剪股颖粒线虫是禾本科植物非常重要的病原线虫，口岸应加大检疫力度，以防该线虫传入我国。