HPLC-DAD-ELSD法同时测定牛膝中β-蜕皮甾酮、人参皂苷R0、竹节参皂苷Ⅳa的含量

杨柳，姜海，苏晓琳，颜美玲，邢绪东，郭新月，侯阿娇，满文静

(黑龙江中医药大学，教育部北药基础与应用研究重点实验室，黑龙江省中药及天然药物药效物质基础研究重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150040)

牛膝为苋科牛膝属植物牛膝(AchyranthesbidentataBL.)的干燥根。根据2015版《中国药典》记载，牛膝作为多年生草本植物，其味甘、苦、酸，性平，具有补肝肾、强筋骨、活血益阴的功效[1]。临床应用广泛，常用于抗炎镇痛、腰膝骨痛、筋骨无力、抗衰老等[2]。牛膝主产于河南焦作地区(古怀庆府)，作为道地药材，属“四大怀药”之一，由于种植历史悠久、质量优良，产量较大，被《本经》认为是上品牛膝[3]。作为常用的中药品种，牛膝的市场需求量较大，在我国河南、河北、山东、内蒙、安徽等地区均有规模化种植。本实验样品主要选取河南主产的部分牛膝药材。根据化学成分研究表明，牛膝中含有甾酮、三萜皂苷和多糖等多种化学成分[4-7]。其中以齐墩果酸为苷元的三萜皂苷和甾酮类成分，可作为牛膝的主要活性成分发挥疗效。2015版《中国药典》中记载牛膝标准仅以蜕皮甾酮的含量作为质控指标，测定成分单一，难以全面评价牛膝的质量，因此本文建立了同时测定甾酮类和三萜皂苷类成分(β-蜕皮甾酮、人参皂苷R0、竹节参皂苷Ⅳa) 的方法，为牛膝的综合质量控制标准提供了实验依据，同时也使牛膝质量的可控性得到进一步提升。以往的文献报道了用HPLC分别测定牛膝中的甾酮类成分和皂苷类成分，样品处理复杂且测定烦琐[8-9]。所以本文用甲醇超声提取法对样品进行处理，采用HPLC-DAD-ELSD联用法一次进样，同时测定牛膝中3种化合物(β-蜕皮甾酮、人参皂苷R0、竹节参皂苷Ⅳa)的含量。建立的样品处理过程和测定方法简单，为多指标控制牛膝药材质量提供了一种快速简便的方法。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

Waters e2695高效液相色谱仪(美国Waters公司)；Waters2998二极管阵列检测器(美国Waters公司)；Waters 2424蒸发光检测器(美国Waters公司)；KQ-500DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；电子天平(AL204系列中国METTLER TOLEDO电子公司)。

1.2 试剂

β-蜕皮甾酮(批号5289-74-7)、人参皂苷R0(批号34367-04-9)、竹节参皂苷Ⅳa(批号51415-02-2)标准品均购自天津西玛科技有限公司，纯度≥98%，供含量测定使用；乙腈(色谱纯，Amethyst公司)；甲醇(色谱纯，Amethyst公司)；甲醇(分析纯，北京化工厂)；甲酸(色谱纯，北京迪马科技有限公司)；异丙醇(色谱纯, Xingmake公司)。

2 方法和结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent 5 TC-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱；流动相：乙腈-0.08%甲酸(A)，水-2.5%异丙醇-0.08%甲酸(B)进行梯度洗脱。见表1。流速为0.9 mL/min，时间80 min。在上述条件下，牛膝中β-蜕皮甾酮、人参皂苷R0、竹节参皂苷Ⅳa化合物的色谱峰与相邻成分可达基线分离，高效液相色谱图见图1。

表1 梯度洗脱条件

注：A：HPLC-DAD检测的对照品；B：HPLC-ELSD检测的对照品；C：HPLC-DAD检测的供试品；D：HPLC-ELSD检测的供试品；1：β-蜕皮甾酮；2：人参皂苷R0；3：竹节参皂苷Ⅳa。图1 β-蜕皮甾酮、人参皂苷R0、竹节参皂苷Ⅳa高效液相图谱

2.2 对照品溶液的制备

精密称取牛膝中3种化合物(β-蜕皮甾酮、人参皂苷R0、竹节参皂苷Ⅳa)的对照品，各加入甲醇溶解制成适当质量浓度的对照品储蓄液。

2.3 供试品溶液的制备

取样品适量，进行粉碎，过筛，精密称取1 g，置于具塞三角瓶中，并加入甲醇10 mL，超声提取40 min，取上清液，滤过，为牛膝的供试品溶液。

2.4 线性关系考察

精密吸取“2.2项”下的对照品储蓄液，配成不同浓度混合对照品溶液。按“2.1”所述方法，注入到液相色谱仪，连续进样6次，测定牛膝中3种化合物(β-蜕皮甾酮、人参皂苷R0、竹节参皂苷Ⅳa)的峰面积。其中β-蜕皮甾酮以浓度(X)为横坐标，峰面积为纵坐标(Y)，进行线性回归计算，得到回归方程，人参皂苷R0、竹节参皂苷Ⅳa以浓度的对数值X为横坐标，峰面积的对数值Y为纵坐标进行线性回归，各回归方程呈良好的线性关系,具体见表2。结果表明，牛膝中3种化合物(β-蜕皮甾酮、人参皂苷R0、竹节参皂苷Ⅳa)分别在0.001 9～0.096 3 mg/mL、0.002 2～0.469 5 mg/mL和0.004 7～0.483 0 mg/mL浓度范围内浓度与峰面积间呈现良好的线性关系。

2.5 精密度试验

精密量取牛膝中3种化合物(β-蜕皮甾酮、人参皂苷R0、竹节参皂苷Ⅳa)的混合对照品溶液,在上述色谱条件下，进样10 μL，重复进样6次，测定供试品溶液中β-蜕皮甾酮、人参皂苷R0、竹节参皂苷Ⅳa 3种化合物的峰面积, 计算RSD值结果。牛膝中3种化合物(β-蜕皮甾酮、人参皂苷R0、竹节参皂苷Ⅳa)色谱峰的RSD值(n=6)分别为0.631 %、1.427 %、0.156%。表明本法精密度较好。

表2 线性关系考察

2.6 稳定性试验

取同一批牛膝样品，按上述方法制备供试品溶液，分别在0、8、16、24、32、48 h进样，在上述色谱柱条件下，测定牛膝中三种化合物(β-蜕皮甾酮、人参皂苷R0、竹节参皂苷Ⅳa)的峰面积，计算RSD值(n=6)。结果RSD分别为2.173%、2.415%、2.003%。表明供试品溶液在48 h内基本稳定。

2.7 重现性试验

取牛膝药材6份，按照“2.3项”下的方法制成6份牛膝供试品溶液，按“2.1项”下色谱条件测定牛膝中3种化合物(β-蜕皮甾酮、人参皂苷R0、竹节参皂苷Ⅳa)的峰面积，计算RSD值(n=6)。结果牛膝中3种化合物(β-蜕皮甾酮、人参皂苷R0、竹节参皂苷Ⅳa)的RSD分别为1.527%、2.230%、1.758%。结果表明,方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

取已知含量的牛膝药材约0.5 g，置具塞三角瓶中，加入甲醇5 mL，共9份，精密加入β-蜕皮甾酮、人参皂苷R0和竹节参皂苷Ⅳa对照品适量，以下按“2.3项”下方法操作，制备加样回收供试品溶液。注入液相色谱仪，进样10 μL，测定加样回收供试品溶液中β-蜕皮甾酮、人参皂苷R0、竹节参皂苷Ⅳa的含量，计算加样回收率，结果见表3。结果表明，用本法测定样品中3种成分的含量回收率良好。

2.9 不同批次牛膝中β-蜕皮甾酮、人参皂苷R0、竹节参皂苷Ⅳa含量测定

取河南产不同批次牛膝样品，按“2.3项”所述方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下，测得牛膝中3种化合物(β-蜕皮甾酮、人参皂苷R0、竹节参皂苷Ⅳa)的峰面积，通过回归方程分别测定其含量，结果见表4。

表3 加样回收率结果

表4 牛膝中 β-蜕皮甾酮、人参皂苷R0、竹节参皂苷Ⅳa含量

3 结论与讨论

牛膝中β-蜕皮甾酮、人参皂苷R0、竹节参皂苷Ⅳa因极性差异较大，使用固定的比例流动相难以同时测定出牛膝中3种化合物(β-蜕皮甾酮、人参皂苷R0、竹节参皂苷Ⅳa)的含量，所以在实验中对流动相梯度进行优化，来测定牛膝中β-蜕皮甾酮、人参皂苷R0、竹节参皂苷Ⅳa的含量。结果在HPLC中3种化合物峰形基本对称，峰与峰间可达较好的分离度。在200～400 nm范围内对牛膝中β-蜕皮甾酮色谱峰进行紫外吸光光谱扫描，结果β-蜕皮甾酮色谱峰在248 nm处有强吸收。甾酮和皂苷作为牛膝的主要成分，由于皂苷类化合物没有紫外吸收，且牛膝中皂苷种类繁多，只用DAD无法同时对牛膝中这两类不同性质的化合物进行测定。而ELSD作为一种通用型检测器，特别适用于没有紫外吸收的皂苷类化合物的测定，所以本文将DAD和ELSD结合起来，建立了HPLC-DAD-ELSD这两种方法结合起来同时测定牛膝中3种化合物(β-蜕皮甾酮、人参皂苷R0、竹节参皂苷Ⅳa)含量。

本研究测得的河南产10个不同批次的牛膝药材中β-蜕皮甾酮、人参皂苷R0、竹节参皂苷Ⅳa的含量分别在0.019～0.963 mg/g、0.022～4.695 mg/g和0.047～4.83 mg/g含量范围内，所以本研究采用的HPLC-DAD-ELSD联用法可作为牛膝定量测定方法。牛膝资源具有明显的道地性，不同生长环境、海拔、光照、土壤性质、温度、水分等因子单一或相互作用影响着其有效成分的积累。且同一省份不同地区牛膝中甾酮和三萜皂苷的含量存在明显的地域差异，所以三萜皂苷可与甾酮类共同作为产地和质量鉴别的指标，为多指标控制牛膝药材提供依据。

本研究采用HPLC-DAD-ELSD法同时测定牛膝中3种化合物(β-蜕皮甾酮、人参皂苷R0、竹节参皂苷Ⅳa)的含量，方法快捷、灵敏、简便。可更科学、全面地对牛膝药材的质量进行评价，并为多指标控制牛膝药材及临床药用提供科学依据。