基于代谢组学的中药“红I号”灌肠液对盆腔炎性疾病后遗症(寒湿瘀滞证)的作用研究

吴丹，陈晨，刘树民，丛慧芳，胡兰锐

(1.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001； 2.黑龙江中医药大学药物安全性评价中心， 黑龙江 哈尔滨 150040； 3.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

盆腔炎性疾病后遗症(Sequelae of pelvic inflammatory disease,SPID)属于盆腔炎性疾病的一种典型遗留病变，既往临床中将其称之为慢性盆腔炎，主要典型症状可见盆腔黏连、腰骶酸痛以及白带异常等[1-3]。由于炎症反复发作，缠绵难愈引起盆腔及周围组织破坏,出现大面积黏连、增生及瘢痕，进而导致临床中不孕症、异位妊娠、月经不调及慢性盆腔痛等疾病的发生。目前，盆腔炎性疾病后遗症的发病率呈逐年上升趋势，且与盆腔炎性疾病发作的次数及严重程度呈正相关。严重影响女性身心健康，降低生活质量，负性影响持续终身[4-5]。中医学认为“血瘀”是本病最终病理结局[6]，也是“新的致病因素”，所以“因果相干”导致本病缠绵难愈。本研究选用的中药“红I号”是由鸡血藤、艾叶、茯苓、牡丹皮、炮姜、赤芍、昆布、桂枝、小茴香和夏枯草10味中草药组成，治疗以“化瘀通络”为基本原则，通过直肠给药的方式，使有效成分与肠道内各种分泌物融合，通过肠黏膜，在肠道黏膜免疫屏障把控下，吸收有益物质进入机体大循环，作用于炎性部位[7-9]。同时通过药物改变肠道微生态，改变肠道菌群分布等方式，改善机体内环境，从而达到治疗盆腔炎性疾病后遗症的目的,临床中对于盆腔炎性疾病(PID)的急、慢性期治疗，均疗效卓著。本研究使用超高压液相色谱-飞行时间质谱仪(UPLC-QTOF-MS)分析盆腔炎性疾病后遗症(寒湿瘀滞证)患者粪便谱图变化，进一步探讨寒湿瘀滞证SPID的产生机制和中药“红I号”的临床作用机制。

1 资料与方法

1.1 临床资料

于黑龙江中医药大学附属第二医院收集符合寒湿凝滞证辨证标准的盆腔炎性疾病后遗症患者28例，及健康自愿者5例。受试者决定是否参加这项研究之前，向其告知可能给带来的益处、风险和不适，同意者签署项目知情同意书。纳入患者的年龄在18～45周岁，已婚或未婚有性生活史者，患病时间为3～60个月之间。将两组患者年龄、病程及病情程度分级进行统计学分析，结果显示治疗组与对照组中患者一般资料差异无统计学意义，具有可比性(P>0.05)。

1.2 药品制备

中药“红I号”来源于黑龙江中医药大学附属第二医院饮片药局，具体药物批号如下：

艾叶10 g(151201)，茯苓15 g(170501)，赤芍15 g(170101)，牡丹皮10 g(170101)，炮姜10 g(170304)，鸡血藤10 g(171201)，昆布10 g(171201)，桂枝10 g(170301)，盐小茴香10 g(170601)和夏枯草10 g(170201)。

1.3 试剂

亮氨酸脑啡肽(L9133，Sigma-Aldrich公司)；甲醇(色谱级，Dikma科技公司)；乙腈(色谱级，Dikma科技公司)。

1.4 仪器

超高液相色谱-飞行时间串联质谱仪(美国Waters公司)；KDC-160HR高速冷冻离心机(科大创新有限公司)；Milli-Q超纯水系统(Milli-Q公司)。

1.5 分组

盆腔炎性疾病后遗症(寒湿瘀滞证)患者28例分为5组，d1为病理模型组，d2为用药第5天，d3为用药第10天，d4为用药第15天，d5为用药第21天，抽提并获得粪便菌群DNA。

1.6 给药

将煎好的中药“红I号”灌肠液取药汁300 mL加热，待温度降至39℃～41℃时，倒入一次性使用灌肠器内，患者取侧卧位，臀部抬高10 cm，将一次性灌肠器插入病人肛门约18～20 cm，调节滴速，大约20 min滴完。灌肠宜在晚上临睡前排空二便后进行，灌肠结束后叮嘱患者忌即刻排出药物，尽量保留3～4 h，若能保留至次晨则最好，每晚1次。灌肠每于月经干净后3天开始，连续用药20天。

1.7 样品收集

以月经前后20天为治疗周期，在无菌操作状态下分别取治疗第0、5、10、15、20天粪便。粪便冻干研磨，以1∶9的比例与甲醇混合,12 000 rpm，4℃，离心10 min，取上清液，进行质谱分析。

1.8 UPLC-MS分析条件

色谱柱：Waters Acquity SDSLCT Premier；进样量2.00 uL；柱温40℃，样品温度10.0℃。分析条件见表1和表2。

1.9 统计学分析处理

在Progenesis QI软件上加载运行。首先对数据进行无监督的主成分分析(PCA)来检查聚类分组的情况；再对数据进行OPLS-DA有监督性型分析，评估每两组数据的差异。S-plot图中，每个点代表准确的质量保留时间，X轴代表变量，红色的点代表VIP>1且P<0.05的离子，离原点越远代表组间可信度最高的离子。将这些差异化合物重新导入到Progenesis QI软件中进行相关分析，通过HMDB、KEGG等数据库进行化合物的分类鉴定，最终用Cytoscape3.4.0软件将获得的化合物和通路的网络图进行可视化。

表1 UPLC条件

注：Time为时间；Flow Rate为流速；流动相A为含0.1%的甲酸-乙腈溶液；流动相B为含0.1%的甲酸-水溶液。

表2 MS条件

2 实验结果

2.1 寒湿瘀滞证SPID患者用药前后粪便代谢物状态

实验结果如图1所示：空白对照组、模型组、中药“红I号”治疗组的粪便具有代表性的BPI图。由于UPLC色谱柱中的小颗粒填料，小分子代谢物在13 min内就能得到很好的分离。

由图1可知，健康患者与SPID患者代谢谱图存在明显差异，表明SPID患者具有独特的粪便代谢物特征。

2.2 寒湿瘀滞证SPID给药后粪便的轨迹

寒湿瘀滞证SPID患者自身用药后粪便代谢表型的经时轨迹变化，如图2所示。寒湿瘀滞证SPID患者用药第20天的粪便代谢表型与其自身对照组(即M)的最远，且与空白对照组最近，说明SPID患者给药后效果显著。结果见表2。

图1 正负离子模式下空白对照组(A、G)、SPID患者(B、H)和中药“红I号”治疗组5 d(C、I),10 d(D、J),15 d(E、K),20 d(F、L)人粪便BPI图。

注：k：空白对照；m：给药前；g5：给药第5天；g10：给药第10天；g15：给药第15天；g20：给药第20天。图2 中药“红I号”对SPID患者代谢表型的经时轨迹变化

2.3 差异表达显示结果

本文使用OPLS-DA模型中变量重要性投影(Variable importance in the projection，VIP)参数评价潜在粪便表征代谢物谱的生物标志物。结果见图3。

图3 正负离子模式下SPID患者相对正常健康人粪便的S-plots图(A、B)和VIP-plots(C,D)

图4 正负离子模式下SPID患者对正常健康人粪便的S-plots图(A、B)和VIP-plots(C,D)

由图3和图4可知，寒湿瘀滞证SPID给药前后，粪便代谢物种均存在差异代谢物。图中选取VIP>1的差异变量，再用t检验对筛选到的差异变量在对照组和给药组间进行验证，只有P≤0.05的差异变量才被认为是潜在的生物标志物。

2.4 寒湿瘀滞证SPID患者粪便代谢物中关键标志物及相关通路

由表3可知，在寒湿瘀滞证SPID患者粪便代谢物中，筛选检测得到8个具有明显差异的化合物，其中寒湿瘀滞证SPID患者相对正常健康人粪便中潜在干预靶点中，4个上调，4个下调。

表3 SPID患者相对正常健康人粪便中潜在生物标志物的鉴定

注：与空白组相比，↑为模型组上调，↓为模型组下调；Rt-m/z为保留时间和质荷比；HMDB ID为HMDB号；VIP value为VIP值；Formula为标记物分子式；Description为标记物英文名称，KEGG为标记物通路。

由图5和表4可知，将8个潜在生物标志物作为SPID患者相对正常健康人粪便中潜在生物标志物，并进行MetaPA识别显著富集通路分析，结果显示8个SPID患者粪便中潜在生物标志物参与5个代谢通路(图6)，分别是甘油脂代谢、甘油磷脂代谢、半乳糖代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、类固醇激素生物合成。

表4 SPID患者相对正常健康人粪便中潜在生物标志物的通路影响

注：1为Glycerolipid metabolism；2为Glycerophospholipid metabolism；3为Arginine and proline metabolism；4为Steroid hormone biosynthesis；5为Galactose metabolism。图5 基于METPA分析的SPID患者相对正常健康人粪便中潜在生物标志物拓扑图

图6 基于METPA分析的SPID患者相对正常健康人粪便中潜在生物标志物拓扑图

3 讨论

代谢组学是研究生物体系受刺激或扰动后其内源性代谢物质种类、数量及其变化规律的应用科学，通过对内源性小分子代谢产物的无歧视分析，以代谢轮廓、代谢指纹及代谢靶标等途径反映系统生化谱和功能调节的整体效果，与强调系统效应的中医药学具有天然的趋同性，从而为用生物学语言表述中医药理论的科学内涵提供了合适的方法。本研究利用UPLC-MS与代谢组学技术相结合，进行中药“红I号”直肠滴入治疗后，对盆腔炎性疾病后遗症(寒湿瘀滞证)多元数据分析及潜在生物标志物鉴定。通过采集样品粪便标本应用代谢组学技术筛选出关键的生物标志物或与疾病有一定相关性的标志物，从而分析药物的吸收功能、代谢功能以及生物利用度等的影响。应用代谢组学技术评价中药“红I号”药效是符合整体作用特点的有效方法。本研究初步阐明了盆腔炎性疾病后遗症(寒湿凝滞证)患者状态下肠道代谢物种微生物的丰度紊乱，中药“红I号”配方干预后的SPID中物质代谢发生明显变化，中药“红I号”提取物干预后，SPID导产生的偏离得到了明显的改善，阐明表达中药“红I号”生物学基础；同时，也进一步揭示了中药“红I号”及盆腔炎性疾病后遗症(寒湿瘀滞证)之间存在相关性，为临床下一步研究奠定客观的理论基础，更为中医经典理论指导下临床治疗盆腔炎性疾病后遗症(寒湿瘀滞证)提供了科学的客观依据，更好地推进临床对SPID诊治方案的完善和优化。