骨骼肌细胞氧化应激损伤与黄芪多糖的干预研究

邓聪，杨志敏，徐福平，孙玉姣，陈玉状，赖艳娴，岑美婷

(1.广州市第一人民医院南沙医院，广东 广州 511457；2.广州中医药大学第二临床医学院，广东 广州 510120)

人体质量的40%～50%由骨骼肌组成[1]，骨骼肌是人体内最大的器官系统。在人体衰老的进程中，骨骼肌是最早受到影响的组织之一[2]，并表现出与年龄相关的变化，如功能障碍和质量损失。大量证据表明，氧化应激(Oxidative stress，OS)导致了骨骼肌萎缩，增加的活性氧簇(Reactive oxygen species，ROS)促进了骨骼肌萎缩的发生，累积的ROS可促进蛋白质水解增加并抑制蛋白质合成[3]。因此，减少骨骼肌中ROS和抑制OS，对于预防和治疗骨骼肌萎缩很关键。文献报道，黄芪多糖(Astragalus polysaccharides，APS)有良好的抗氧化作用[4]。本实验通过建立氧化应激骨骼肌细胞模型，观察APS对其的影响，为今后的实验提供依据。

1 材料和方法

1.1 细胞和试剂

细胞培养：C2C12骨骼肌细胞，购自中国科学院细胞库，使用含10%新生胎牛血清、1%青霉素和1%链霉素的DMEM，在37℃、5% CO2、95%湿度培养箱培养。2～3 d/传代，待进入生长对数期后进行分组实验。

APS(美国泛华生物公司)；新生胎牛血清、青霉素和链霉素(四季青生物工程研究所)；DMEM培养基(Hyclone公司)；DCFH-DA、过氧化氢(H2O2)(Sigma公司)；AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒(凯基生物有限公司)。

1.2 氧化应激骨骼肌细胞模型

将对数生长良好的骨骼肌细胞接种于96孔培养板(密度5×104/mL)，根据H2O2浓度分为4组：100 μM(100组)、200 μM(200组)、300 μM(300组)、400 μM(400组)及正常组，每组6个复孔，分别培养12 h、24 h。MTT法检测(设调零组)，每孔加入50 μL MTT，37℃温育4 h，吸弃上清液，加入200 μL DMSO，振荡10 min，在酶标仪上用570 nm波长检测各孔OD值。

1.3 细胞增殖率

将对数生长良好的骨骼肌细胞，分为3组：正常组、100 μM H2O2组(模型组)、100 μM H2O2+0.2 mg/mL APS组(干预组)，每组6个复孔并培养24 h。MTT法检测(方法同上)。

增殖率(%)=(实验组OD值-调零组OD值)/(对照组OD值-调零组OD值)×100%

1.4 细胞凋亡率

上述3组培养24 h后，用AnnexinV-FITC细胞凋亡试剂盒检测。用胰酶消化细胞，PBS洗涤2次后重悬细胞，计数取1×106/mL细胞，加入5 μL Annexin V-FITC、5 μL碘化丙啶染色液混匀，温避光孵育10 min，流式细胞仪检测。

1.5 细胞ROS水平

上述三组培养24 h后，用DCFH-DA探针标记法检测。用胰酶消化细胞后，收集细胞悬浮于浓度为10 μM的DCFH-DA中，密度1×106/mL，37℃孵育20 min，用不含血清细胞培养液洗涤3次以除去DCFH-DA，流式细胞仪检测。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 不同浓度的H2O2对骨骼肌细胞的影响

与正常组比较，100组、200组、300组和400组在12 h、24 h内骨骼肌细胞的增殖率均显著下降(P<0.01)。见图1。

注：与正常组比较，*P<0.01。图1 不同浓度的H2O2对骨骼肌细胞的影响

2.2 各组增殖率、凋亡率、ROS水平的比较

与正常组比较，模型组和干预组的增殖率均下降，凋亡率和ROS水平均升高(P<0.01)。与模型组比较，干预组的增殖率上升，凋亡率和ROS水平均下降(P<0.01)。见图2。

注：与正常组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.01。图2 各组增殖率、凋亡率、ROS水平的比较

3 讨论

衰老是一个依赖于时间的生理过程，也是人类慢性病发生和发展的最大风险因素。由于人类对预期寿命的增加，研究衰老变得尤为重要。人类在25周岁之后，骨骼肌质量就以3%～10%/10年的速度丢失。随着年龄增长而发生的骨骼肌质量和功能的进行性减退，称为骨骼肌减少症，也称肌肉减少症(Sarcopenia)[1]，已被公认为老年综合症。大量研究指出，骨骼肌能够控制其他组织代谢或衰老的速度，是年龄相关疾病(Age-related diseases，ARD)发展的重要危险因素，如代谢综合征、阿尔茨海默氏症、慢性心衰、癌症等[5]。因此，骨骼肌是人体组织衰老的关键调节因子。

氧化还原紊乱导致肌肉萎缩的假设最早在1991年由Kondo等[5]提出。Pham等[6]研究发现，将肌细胞暴露于H2O2中，可使其蛋白质合成减少约90%。本实验中，H2O2浓度在100 μM以上各组与正常组比较均有统计学意义(P<0.01)，提示100 μM H2O2是氧化应激骨骼肌细胞模型的有效浓度。随着H2O2浓度的增加，骨骼肌细胞的增殖率显著下降(P<0.01)。研究指出，ROS在骨骼肌中积累导致的氧化还原状态改变，在肌肉减少症中发挥重要作用[7]。本实验用100 μM H2O2制作氧化应激骨骼肌细胞模型，结果显示模型组的ROS水平及凋亡率均显著升高(P<0.01)。

肌肉减少症相当于中医的“痿证”“虚劳”等证，主要病机为脾肾亏虚。《景岳全书·脾胃》曰：“精血之海，必赖后天为之资。故人自生至老，凡先天之有不足者，但得后天培养之力，则补天之功亦可居其强半。”由此可见，补脾益气是延缓衰老的关键。中药黄芪具有广泛的药理作用，包括抗氧化、延缓衰老、神经保护等[8]，APS是其主要活性成分占50%以上。本实验予0.2 mg/mL APS干预后，骨骼肌细胞的增殖率显著升高(P<0.01)，ROS水平及凋亡率均显著下降(P<0.01)，与模型组比较有显著性差异(P<0.01)。提示APS有良好的抗氧化，改善肌肉减少症的作用，但具体的分子机制有待我们下一步的研究。