甜瓜全基因组R2R3MYB转录因子基因的识别与分析

张爽爽 陈 莹 张金鹏 耿 伟 王利波 惠长敏*

（吉林省蔬菜花卉科学研究院 130033）

MYB转录因子是广泛存在于植物基因组内的一类基因家族，参与植物生长发育及抵御生物或非生物胁迫等生理过程[1、2、3]。

MYB蛋白以含有一段保守的DNA结构域为共同特征，DNA结构域内含有1～4个串联的、不完全重复的MYB重复区域，根据含有的MYB重复区域数目的不同可将MYB蛋白分为4个亚类：第一亚类是R1/R2-MYB，该亚类的特征是含有一个R或含有两个R但间隔较远的MYB-related；第二亚类是含有两个R的R2R3MYB；第三亚类是含有三个R的3R-MYB又叫pc-MYB；第四亚类是含有四个类似R1/R2结构域的4R-MYB，该亚类在植物基因组中存在数目较少，只在个别植物中有报道[4、5]。

目前研究较多的是R2R3MYB，这一亚类的MYB基因广泛地参与植物体的苯丙烷类物质代谢调控[5、6、7、8]、细胞周期循环调控[9、10、11]以及对逆境胁迫做出应答等生理活动[12、13]。

R2R3MYB在植物基因组中数量较多，据报道拟南芥基因组中有137个[4]、玉米基因组中有158个[14]、大豆基因组中有244个[15]、蒺藜苜蓿基因组中91个[15]、葡萄基因组中122个[15]、水稻基因组中有103个[15]。

2012年甜瓜基因组数据已经公布[16]，但是对甜瓜全基因组中的R2R3MYB转录因子的研究还未见报道。

本研究以甜瓜基因组为研究对象，利用已知的R2R3MYB基因的结构域进行BLASTP检索，发掘甜瓜中的R2R3MYB基因，利用生物信息学软件对其蛋白结构域、保守基序等进行分析，并与拟南芥R2R3MYB转录因子构建亲缘进化树，以期对甜瓜中R2R3MYB基因的功能进行初步的预测。

1 材料及方法

1.1 R2R3MYB转录因子的搜集

利用拟南芥基因组中R2R3MYB蛋白的结构域序列在MELONOMICS数据库中进行Blastp搜索，获取甜瓜基因组中R2R3MYB转录因子的基因编号、蛋白序列及开放阅读框序列等信息，删除重复和不完全序列；利用SMART和EXPASY数据库对获取的R2R3MYB蛋白的结构域进行分析和鉴定，删除不具有典型结构域的序列，将这些数据作为原始数据进行保存。

1.2 R2R3MYB转录因子的生物信息学分析

利用MAFFT在线软件进行多重序列比对，输入氨基酸序列后设置默认参数；利用MEME在线软件对甜瓜中R2R3MYB蛋白的保守基序进行分析，参数设置如下：最大基序数50、基序最长氨基酸个数200、基序最短氨基酸个数6，其他参数为默认设置；使用 MEGA6.0构建系统发育树，采用邻接法（NJ），bootstrap analysis设置为1000次。

2 结果与分析

2.1 R2R3MYB转录因子的鉴定

利用拟南芥基因组中137个R2R3MYB蛋白的结构域序列在甜瓜数据库中进行搜索，共得到73个R2R3MYB转录因子基因，利用EXPASY和SMART在线软件分别对获取的R2R3MYB蛋白的结构域进行分析和鉴定，其中有3个基因不具有R2R3MYB蛋白典型结构域，删除这3条序列，最后得到了70个具有R2R3MYB蛋白典型结构域的基因，分别命名为MYB1-MYB70，蛋白序列中氨基酸的个数为166-553个不等（详见表1）。

2.2 生物信息学分析

为了解甜瓜R2R3MYB基因结构域的特征及其中重要的氨基酸位点，我们首先进行多序列比对，如图1所示，从序列比对结果可以发现甜瓜R2R3MYB保守区域含有108个氨基酸，只有个别的序列存在缺失和插入；第一个MYB重复区域含有3个保守的色氨酸残基（W），第二个MYB重复区域内某些保守的色氨酸残基（W）被亮氨酸（L）、异亮氨酸（I）、苯丙氨酸（F）等取代，这种现象在其他物种中也存在，可能与植物进化过程有关[15]。

我们进一步通过MEME软件对70个R2R3MYB基因的保守基序进行了分析，如图2所示，甜瓜R2R3MYB基因含有多个保守的基序，这些保守基序的存在与该基因发挥的功能相关。

为了对甜瓜中R2R3MYB基因的功能进行初步的预测，我们将甜瓜中R2R3MYB基因与拟南芥中的R2R3MYB基因共同构建系统进化树，如图3所示，根据文献报道的拟南芥R2R3MYB基因亚家族的划分，本文中将甜瓜R2R3MYB基因划分为27个亚家族[4]，结果如表2所示，根据拟南芥亚家族中R2R3MYB基因的功能初步预测甜瓜中R2R3MYB基因可能发挥的作用。

表1 甜瓜中R2R3MYB基因的蛋白序列号及结构域分析

图2 甜瓜中R2R3MYB基因的保守基序分析

图3 甜瓜与拟南芥中R2R3MYB基因的亲缘进化树

表2 甜瓜中的R2R3MYB基因亚组的划分

3 讨论

R2R3MYB基因在植物基因组中数量较多，本研究在甜瓜基因组中发掘70个R2R3MYB基因，占甜瓜总转录因子数的5%，这也说明R2R3MYB基因在甜瓜生长发育过程中发挥着重要的作用。MYB转录因子的每个MYB的重复区域中含有3个高度保守的色氨酸残基（W），MYB蛋白发挥功能时氨基酸会折叠成螺旋-转角-螺旋（HTH）的形式参与DNA大沟的结合，保守的色氨酸残基起着疏水的作用，对维持HTH的构型有着特别重要的意义[4]。本研究中发现甜瓜R2R3MYB基因的第一个MYB重复区域含有3个保守的色氨酸残基（W），但是第二个MYB重复区域内的保守的色氨酸残基（W）被亮氨酸（L）、异亮氨酸（I）、苯丙氨酸（F）等取代，通过查找文献发现这种现象在其他物种中也存在，这可能与植物进化过程有关[15]。

为了发掘甜瓜基因组中存在的进化过程中功能保守的R2R3MYB基因，我们将甜瓜中R2R3MYB基因与拟南芥中的R2R3MYB基因共同构建亲缘关系进化树，并通过划分亚组初步预测其功能。例如在SG8中，AtMYB42和AtMYB85被证明在拟南芥中参与木质素生物合成代谢调控[17]，甜瓜中MYB54和MYB56在亲缘进化树中表现出进化关系较近，若这类基因在进化过程中功能保守，甜瓜中MYB54和MYB56也可能参与木质素生物合成代谢调控。我们的研究初步预测了甜瓜中可能参与苯丙烷类物质代谢、生物及非生物胁迫反应的R2R3MYB基因，为后续基因功能的研究奠定基础。