元胡的根际细菌群落组成及种源差异

经洒洒 郁吉锋 宋腾蛟 杨蒋舜 高建莉 袁小凤

（1.浙江中医药大学，浙江杭州 310053；2.浙江理工大学，浙江杭州 310018）

0 引言

元胡Corydalis turtschaninovii 又名延胡索、玄胡，为罂粟科紫堇属多年生草本植物，与白术、芍药、贝母等并称“浙八味”，为大宗常用中药。性温，味辛苦，是活血化瘀、行气止痛的良药。在我国，元胡主要分布在安徽、江苏、浙江、陕西等地，其中，在浙江省东阳市已有1200多年的种植历史，逐渐形成了特有的品质和地道产区，中药材向来注重道地性，然而随着产业的需求和种植规模的扩大，就需要不断的引入新种源，这势必会对药材的产量和品质造成不同程度的影响。中药材质量可因产地不同而存在明显差异，这些与植物、土壤和微生物所构建的土壤生态系统密切相关。

土壤微生物是土壤生态系统中重要的组成部分，在土壤养分的转化循环、系统稳定性、抗干扰能力以及可持续利用中占据主导地位。有研究表明，土壤微生物不仅能促进植物对矿质元素的吸收，还具有增强植物抵抗生物和非生物胁迫能力等作用。因此，中药材道地性应研究不可忽视的根际微生物。本文选择元胡道地产区 (浙江东阳) 和非道地产区 (陕西汉中、浙江磐安) 药用元胡为研究对象，运用Miseq测序技术，研究不同种源药用元胡根际土壤细菌菌的多样性，旨在为中药材道地性理论提供科学的实验证据。

1 材料与方法

1.1 实验设计与样品采集

试验田设在东阳市农业科学研究所实验基地。本实验选择不同种源的元胡种，主要包括金华市东阳市老区-东门村、金华市东阳市老区-马宅镇、金华市东阳市新区-南马镇、金华市东阳市老区-龙泉村、金华市磐安-冷水镇、陕西-汉中市6个种源。于2017年9月25日将元胡种植在实验田中，按上述不同种源将实验分为6组，即道地-东门，道地-马宅，道地-南马，道地-龙泉，非道地-冷水，和非道地-汉中组。每组10株，每个处理6个重复。于2018年5月4日元胡采挖时，采集其块茎，收集根际土。

1.2 土壤细菌多样性检测

采用Omega试剂盒提取土壤DNA，具体步骤按其说明书进行。得到的DNA 做为模板，采用Ependorf的PCR system2700 型基因扩增仪，以Miseq测序平台的V3-V4通用引物（融合341F引物：CCTACACGACGCTCTTCCGATCTN (barcode)CCTACGGGNGGCWGCAG融合805R引物：GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAG AATTCCAGACTACHVGGGTATC TAATCC），进行扩增。采用普通PCR策略：94℃预变性3min，94℃变性30s，45℃退火20 s，65℃延伸20s(重复5个循环) ；再以94℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸30s (重复5个循环) 最后再72℃延伸5min。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。将目的产物用凝胶回收试剂盒进行割胶回收，回收产物用Qubit2.0定量，根据测得的DNA浓度，将所有样品按照1：1的比例进行混合；混合后充分震荡均匀。送上海生工生物工程有限公司进行Miseq测序。

表1 不同处理组土壤的细菌多样性及丰富度

表2 不同处理组门水平的分类及百分含量

表3 不同处理组优势菌属的分类及百分含量

1.3 数据处理及分析

Miseq数据采用Flash软件融合双末端序列，而后通过各样品barcode使数据回归样品，并对各样本序列做QC，去除非靶区域序列及嵌合体。物种分类，采用RDP classifier将序列进行物种分类，对每个样本和每个物种单元分类进行序列丰度计算构建样本和物种分类单元序列丰度矩阵。OTU聚类，将多条序列根据其序列之间的距离来对它们进行聚类，后根据序列之间的相似性作为域值分成操作分类单元（OTU）。α多样性分析，计算各种物种多样性指数，衡量样本物种多样性。β多样性分析，β多样性指标用来比较多组样本之间的差别度量，将代表性序列比对参考核心16S rDNA序列，根据多序列队列构建代表性序列为节点的进化树，利用Unifrac算法计算样本距离、样本聚类、样本PCOA。

2 结果

2.1 根际土壤细菌丰度及多样性的种源差异

基于Miseq测序结果，根据OTU的丰度信息，使用稀疏曲线对元胡根际细菌群落多样性进行评估。稀疏曲线显示当样本测序的序列较少时，OTU数剧增，而随着测序量的不断增大，OTU数目趋于平缓，表示各个样本达到了环境样品的取样深度，测到了绝大多数种类的微生物。

利用Miseq测序技术检测元胡根际土壤细菌多样性及组成（表1），OTUs和ACE是菌群丰度的评估指标，Shannon指数是细菌多样性的评估指标。从表1可知，道地各种源之间细菌丰度及多样性水平无显著性差异，而陕西汉中种引种到东阳后，其细菌多样性水平与丰度相对磐安种源有所下降，但与东阳种源之间无显著性差异，而磐安冷水相对于东阳南马种源的细菌丰度及多样性水平无显著性差异。由此可知，不同种源之间元胡根际细菌多样性水平整体差异不大，影响元胡细菌多样性或许有其他相关因素。

图1 不同处理组根际细菌主成分分析图

2.2 根际土壤细菌结构的种源差异

2.2.1 门水平上的差异

对元胡根际细菌门的多样性进行分析发现，本研究共有34个菌门被鉴定，结果如表2所示。在所有样品中，变形菌是丰度最高的门类，分别占有总序列数的37.4%-42.5%，其次为酸杆菌、放线菌和厚壁菌；24个菌门为6个种源共有，占总菌门的70%，分别为拟杆菌、疣微菌、芽单胞菌、厚壁菌、浮霉菌、绿弯菌等。分析发现，这些共有菌门在不同种源间均无显著性差异。当然，有些种源亦有特有菌，如梭杆菌门为非道地汉中组特有，泉古菌为非道地冷水组特有，不过这些特有菌的丰度极低，所占比例均为0.01%。总之，不同种源元胡根际细菌门水平上无显著性差异。

2.2.2 属水平上的差异

从属水平上分析可知，6个种源分别具有637、580、604、652、620及680个属，每个种源属组成差异不大，选取每个处理组中排名前20的属作为优势菌属（表3）。对优势菌属进行分析发现，10个优势菌属为其共有，分别为Gp1、芽单胞菌属（Gemmatimonas）、Rhizomicrobium、Gaiella、芽孢杆菌属（Bacillus）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、Gp3、Gp2、Rudaea和伯克氏菌属 (Burkholderia)，其中，Gp1含量最高，所占比例为7.3%-8.1%，其次为芽单胞菌属、鞘氨醇单胞菌属和Gaiella，所占比例分别为4.4%-4.8% 、2.9%-3.6%和2.8%-3.7%，分析发现，排名前三的Gp1、芽单胞菌属和鞘氨醇单胞菌属在6个种源间所占比例均无显著性差异；除上述含量相对较高的优势菌属之外，我们发现，假单胞菌、伯克氏菌属和固氮菌慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）也是他们的优势菌属，对比之后发现，这些菌属在不同种源之间均无显著性差异；而6个种源间优势菌属的组成也存在一定的差异，这主要体现在不同种源之间拥有其特有属，如：Rhodoplanes、Nitrosospira为道地产区特有，Dongia、Tumebacillus、Aquisphaera只出现在磐安种中，而Chitinophaga和Thermosporothrix却仅在汉中组出现，但这些优势菌属丰度较低，所占的比例均小于1%。由此可知，不同种源元胡根际细菌多样性在属水平上整体差异不大。

2.3 主成分分析不同处理组根际细菌的差异

主成分分析（PCoA）结果如图1所示。P1和P2分别解释了40.1%和12.6%的变异率。由图可知，6个种源之间聚为一类，没有体现差异性，这与OUTs和Shannon指数一致。

3 讨论

道地药材是传统的、公认的且来源于特定产地的名优正品药材，是中药材精粹之所在，也是历代医家防病治病最有力的武器之一。元胡有1200多年的栽培历史，传统认为浙江东阳为元胡的道地产区，目前认为元胡主要产地位于浙江东阳和磐安、陕西汉中，而湖北、湖南、江苏等省区也有栽培。目前，关于元胡土壤微生物的研究较少，而围绕中药材道地性方面的研究更加缺乏。因此，本研究采用Miseq测序技术，研究6个种源元胡根际细菌群落的多样性，以期为中药材的道地性与根际土壤微生物的相关性研究奠定基础。

通过对元胡根际细菌多样性进行分析，我们发现，OTU及Shannon指数均表明元胡根际细菌多样性整体差异不大，在门水平上亦无显著性差异，属水平上整体差异不大，因此，我们得出结论，不同种源元胡根际细菌多样性整体无显著性差异，种源对土壤根际微生物的影响微乎其微。

而不同种源间土壤根际微生物的无差异性在以往的研究中亦有体现。李国斌等研究了不同种源蒙古黄芪根际微生物的变化，结果表明，不同种源根际细菌及真菌丰度均无显著性差异；邵士成等研究了云南元江印楝植物内生真菌的种类组成，结果表明，不同地理种源印楝植物内生真菌的种类组成没有明显差异，但王戈等研究发现，不同品种的烤烟根际微生物存在差异，苗则彦等人同样发现不同品种的黄瓜根际真菌、放线菌数量存在明显差异，与我们的研究结果不同，由此可知，种源对微生物多样性的影响会因物种的不同而产生不同的作用，这可能和物种与微生物的根际互作有关，值得进一步研究。微生物可以成为药材植株的内生菌，影响药材植株的次生代谢，如参与合成次生代谢产物或是植株在内生菌的刺激下合成更多的防御性化合物，最终成为影响药材道地性的一个因素。

同样的种植环境，种源的不同并未对元胡根际细菌的多样性产生影响，由此可见，土壤与环境等相关因素的作用或许是造成元胡根际细菌多样性的主要原因。相关研究发现，土壤理化特性如颗粒大小、pH值及有机质的含量等因素均会影响根际微生物的种群结构与功能，而土壤pH值的增加还能在一定程度上改善植物根际微生物的结构，如增加生防菌荧光假单胞菌的数量；苗翠苹等人分析了三七根际土壤中微生物群落的变化与环境因子之间的关系，结果表明，真菌和细菌的数量变化均与环境因子有显著性关系，细菌群落受到了更大的影响，而土壤中的总磷、有效磷、水解氮及pH是影响细菌群落结构的重要因素。同样，本课题组前期研究发现，浙贝母菌群结构和组成是浙贝母物种与土壤共同作用的结果；Berg等人同样认为植物物种和土壤类型共同决定着根际微生物的结构和功能。因此，我们推测，种源对元胡根际细菌多样性影响不大，而土壤环境等因素是决定元胡根际细菌多样性的主要因素。

除此之外，通过对不同种源的优势菌属分析发现，不同种源间的优势菌属假单胞菌（Pseudomonas）、伯克氏菌属 (Burkholderia)和固氮菌慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）等所占比例并未产生显著影响。有研究表明，假单胞菌（Pseudomonas）能产生活性物质，抗多种植物病害；伯克氏菌属 (Burkholderia)为根系促生菌（PGPR），其作用在番茄、美洲商陆和籽粒苋等植物中都已证实；慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）是豆科植物主要的固氮菌，可和豆科植物形成共生体，是陆生系统中固氮主要来源，这些细菌对药用元胡的生长乃至元胡的药材品质有着怎样的影响有待进一步研究。

综上所述，基于Miseq测序的方法显示，东阳产区元胡根际细菌具有丰富的多样性，不同种源间元胡根际细菌多样性在门及属水平上均无显著性差异。因此我们得出结论，种源并不是影响元胡根际细菌多样性的主要因素，而土壤环境等因子的作用或许是决定元胡根际细菌多样性的关键因素。除此之外，为了更好地阐明植物-土壤-微生物三者之间的关系，种源对元胡产量及品质的影响还需进一步的研究。