利用下一代测序进行的罗氏易位携带者1例遗传学诊断

邓 庆，马 健

(1.锦江生殖成都西囡妇科医院检验科,四川成都 610000；2.四川锦欣妇女儿童医院检验科,成都 610000)

罗氏易位指2个近端着丝粒染色体在着丝处或其附近断裂后融合成为1个染色体，导致染色体数减少，长臂数不变，短臂数减少2条的现象。罗氏易位发生在5条近端着丝粒染色体(13、14、15、21、22号染色体)上，罗氏易位携带者只有45条染色体，缺少1条染色体[1]。其人群携带率为1.23/1 000，占不孕人群的2%～3%[2]。

一般而言，发生罗氏易位的5条染色体短臂的丢失不会对个体发育产生严重影响。虽然表型正常，由于在第1次减数分裂过程中罗氏易位携带者生殖细胞易位染色体和相应2个正常染色体配对会形成3价染色体，这种结构会导致交替、邻式和不常见3∶0 3种分裂方式的出现[3]。只有交替可产生正常或平衡的配子，其他2种方式产生非平衡的配子，一旦罗氏易位携带者与健康者婚配，这种占大部分的非平衡配子可能会导致易位携带者出现妊娠困难或妊娠过程中反复流产，甚至会导致21-三体综合征、13-三体综合征等先天缺陷患儿的出生[4]。

罗氏易位是导致不孕及妊娠质量不高的一种家族遗传性疾病[5]。本研究选取一对有过胚胎停育和自然流产史、女方属高龄产妇、男方携带罗氏易位衍生染色体的夫妇，通过对其体外受精得到的胚胎进行胚胎植入前遗传学检测，通过一定的分析方法进行比对验证从而挑选出正常合适的胚胎进行移植，可避免临床上罗氏易位携带者异常胚胎植入后的选择性终止妊娠，大幅度降低了妇女身心痛苦和妊娠失败风险，阻断罗氏易位疾病的垂直传播[6]；减轻社会和家庭负担。

1 资料与方法

1.1样本来源 女方37岁，1次胚胎停育，3次自然流产。男女双方染色体核型分析：女方核型正常，男方罗氏易位携带45，XY，-13,-14，+Rob(13∶14)。申请胚胎植入前遗传学筛查(PGS)技术助孕，采用促排卵方案后采卵1次，体外受精得到囊胚4枚，通过胚胎活检对4个囊胚期滋养外胚层细胞进行采样同时采取夫妻双方外周血基因组样本，通过达瑞生殖PGS检测筛查出染色体不平衡胚胎，并经伦理学审查和达瑞生殖技术性手段胚胎植入前遗传学诊断(PGD)来检测与构建受检胚胎的单体型。

1.2仪器及耗材 REPLI-g®single Cell Kit(24)购自QIAGEN企业管理(上海)有限公司，Ion AmpliseqTMLibrary Kit 2.0购自美国life公司，Agencourt AMPure XP购自美国BECKMAN公司，QubitTMdsDNA HS Assay Kit购自美国Life公司，KAPA SYBR®FAST Universal qPCR Kit购自美国KAPA公司，PCR扩增反应试剂购自日本TaKaRa，所有引物合成自美国invitrogen公司，测序试剂均购自美国life公司。Qubit®3.0 Fluorometer荧光计购自美国Life公司，定性PCR仪(ABI3130)、实时荧光定量PCR仪(ABI7500)均购自美国ABI公司，DA8600半导体测序仪购自美国Life公司。

1.3方法

1.3.1单细胞全基因组扩增 基于准随机引物线性扩增的原理并根据单细胞全基因组扩增试剂盒(REPLI-g®single Cell Kit)说明书对每个囊胚期滋养层细胞进行细胞裂解、预扩增、指数扩增和扩增产物纯化，产物浓度稀释10倍后经荧光定量仪(Qubit 3.0)测浓度。

1.3.2文库构建 100 ng DNA经文库构建试剂盒(Ion AmpliseqTMLibrary Kit 2.0)构建文库DNA。PCR特异性扩增目的片段，在DNA片段两端加上通用测序接头，PCR扩增文库DNA，磁珠纯化去除杂质；文库构建后Qubit 3.0测浓度。多重PCR所需引物250对均用Ampliseq网站设计，由invitrogen公司合成。

1.3.3高通量测序文库qPCR定量 根据Qubit 3.0测定的浓度结果，取2 μL文库样品稀释至200 pM。根据实时定量PCR试剂盒(KAPA SYBR®FAST Universal qPCR Kit)配制反应总体系。稀释后的文库样品和标准品各取4 μL进行定量。反应结束后根据循环数计算每个文库样本的实际浓度。

1.3.4上机模板制备与测序 根据每个样本测序数据量和测序深度确定文库的混样个数进行模板制备，使用模板制备试剂盒(Ion PGMTM Template OT2 200 kit)制备测序模板；然后进行阳性模板的富集即去除杂质及扩增失败的测序模板；最后使用高通量测序试剂盒(Ion PGMTM Sequencing 200 kit v2)在 PGMTM测序平台上进行测序。

1.4数据处理 数据下机后进行生物信息分析。首先对下机的原始数据进行测序质量评估，去除接头序列，通过Torrent Mapping Alignment Program软件比对到人类基因组参考序列hg19上，通过samtools统计覆盖倍数，通过GATK calling SNP基因型分析，最后结合家系进行SNP连锁分析，对患者样本13、14号染色体进行单体型构建，进行结果判定。

2 结 果

2.1胚胎测序结果分析 下一代测序(NGS)检测结果汇总见表1。F为父亲样本，M为母亲样本，F1、F2为父亲样本13号染色体的2条染色体单体(其中F1为父亲携带的13号与14号发生了罗氏易位的衍生染色体)，M1、M2为母亲样本13号染色体的2条染色体单体。1号胚胎7号染色体有26.12 Mb的缺失且遗传了父亲的罗氏易位衍生染色体为罗氏易位携带胚胎；2号胚胎14号染色体有82.99 Mb的缺失且为染色体不平衡胚胎；3号胚胎染色体数目正常且没有遗传到父亲的罗氏易位衍生染色体，为正常胚胎；4号胚胎染色体数目正常且遗传了父亲样本的罗氏易位衍生染色体，为罗氏易位携带胚胎。

2.213、14号染色体单体型构建结果 父、母亲与4个受检胚胎13、14号染色体单体型构建的结果见表2、3。遗传了罗氏易位衍生染色体F1的1号胚胎13号染色体上20个SNP位点与14号染色体上28个SNP位点信息与父亲样本的F1染色体相同；而同样遗传了罗氏易位衍生染色体F1的4号胚胎13号染色体上20个SNP位点与14号染色体上27个SNP位点信息与父亲样本的F1染色体相同；说明1、4号胚胎的罗氏易位衍生染色体确实来源于父亲。2号胚胎14号染色体只有1条染色单体，为染色体缺失；3号胚胎13号与14号染色体则遗传了父母双方的正常染色单体。

表1 4个胚胎的NGS结果汇总

表2 13号染色体单体型构建结果

续表2 13号染色体单体型构建结果

注：S17081801-F表示父亲样本；S17081801-M表示母亲样本；S17081801-1表示1号受检胚胎；S17081801-2表示2号受检胚胎；S17081801-3表示3号受检胚胎；S17081801-4表示4号受检胚胎；SNP_1～SNP_20表示受检样本13号染色体上的1号SNP位点到20号SNP位点；“：”和“|”分别表示父母样本和子代样本同一条染色体相邻2个SNP的分隔符，均起到区分作用；“？”表示未知的结果或者是检测到SND但无法确定

表3 14号染色体单体型构建结

注：S17081801-F表示父亲样本；S17081801-M表示母亲样本；S17081801-1表示1号受检胚胎；S17081801-2表示2号受检胚胎；S17081801-3表示3号受检胚胎；S17081801-4表示4号受检胚胎；SNP_1～SNP_20表示受检样本14号染色体上的1号SNP位点到20号SNP位点；“：”和“|”分别表示父母样本和子代样本同一条染色体相邻两个SNP的分隔符，均起到区分作用；“？”表示未知的结果或者是检测到SND但无法确定

3 讨 论

胚胎植入前遗传学检测是在体外受精-胚胎移植基础上对卵母细胞或种植前胚胎进行活检，利用分子生物学手段进行检测，选择正常或遗传表型正常的胚胎移植，从而有效降低流产率，提高活产率，避免选择性终止妊娠。

胚胎植入前遗传学检测主要包括PGS和PGD 2个方面，PGS是对胚胎23对染色体非整倍体异常、微缺失、微重复异常进行筛查，选择没有发生染色体数目和结构异常的胚胎进行移植，有效降低早期流产风险，显著提高临床妊娠率。PGD是针对不同的病因在胚胎着床之前即对配子或胚胎进行遗传物质分析，选择没有发生染色体数目和结构异常的胚胎进行移植，可有效阻断家族遗传病的垂直遗传。

对染色体罗氏易位携带者进行PGD检测，目前已被报道的检测技术主要包括荧光原位杂交技术(FISH)、微阵列比较基因组杂交(aCGH)及NGS，这些检测技术均在对染色体易位的检测中发挥了重要作用，各有优势，同时，也均具有一定的局限性。

FISH技术曾是PGD主要的遗传学方法之一，用以筛查染色体臂间倒位及易位，判定是否存在嵌合以及染色体异常[7]。其局限性主要表现在由于探针数量或染料种类的限制，FISH技术无法全面检测23对染色体[8]；2012、2013年波兰学者LUKASZUK博士分别利用FISH技术和NGS作为技术手段对一对男方携带有14、15号染色体罗氏易位衍生染色体的夫妇进行PGD检测辅助生殖，2012年1月进行FISH检测挑选后移植，但由于FISH技术无法对染色体数目进行全面筛查，所植入胚胎在第10个孕周时流产；2013年9月该团队取样10枚囊胚期胚胎细胞，采用与本研究同样的NGS检测技术，经全基因组扩增利用Ion PGM测序仪及其配套NGS试剂进行测序，根据分析结果挑选1枚健康胚胎移植，成功辅助夫妇诞下一名健康婴儿[9]。说明了NGS技术可实现检测胚胎是否携带罗氏易位衍生染色体的同时还对染色体是否发生了非整倍体数目异常进行检测，首先排除会造成流产或先天性出生缺陷的染色体数目异常胚胎，实现更加全面的遗传学检测。

aCGH技术是与FISH相关、能筛查出胚胎染色体数目异常的检测技术，但aCGH与本研究中应用的NGS在筛查染色体数目异常的准确率方面存在差异，2015年YANG等[10]采用NGS技术进行了79例植入前遗传学检测，采用aCGH进行了78例植入前遗传学检测，采用NGS检测的流产率为1.3%，采用aCGH检测的流产率为2.6%；2016年NISSON等[11]将NGS和aCGH进行了对比研究，结果显示，NGS准确率为95%，aCGH准确率为87%。故相对于FISH，本研究采用的达瑞生殖基于Ion PGM测序仪在胚胎活检后进行NGS的检测方法在罗氏易位携带者检测方面在实现更加全面的检测同时在染色体数目异常检测的准确率方面优于aCGH技术，且通过一个配套的实验流程，使用同一套仪器设备能同时达到染色体数目筛查和罗氏易位衍生染色体检测的目的，让PGD检测更加全面、精确和便捷。

作为新型罗氏易位携带者PGD检测技术，NGS本身也具有一定的局限性，如因单细胞全基因组扩增(WGA)过程中可能存在的等位基因脱扣有可能造成误诊或漏诊[12]。而本研究在NGS的数据分析中结合了核型分析的结果在13号染色体区域选了20个SNP位点、14号染色体区域上选取了28个SNP位点进行家系单体型构建，再通过SNP连锁分析构建4号受检胚胎13、14号染色体的单体型，有效避免了等位基因脱扣对检测结果判读的影响；而在2017年XU等[13]采用同样基于NGS检测技术的等位基因映射识别携带者单体型技术对3对罗氏易位携带者夫妇的12例胚胎先后进行罗氏易位携带者PGD检测与分析，对特定区域选取了6个SNP位点进行连锁分析来构建单体型，其中2对夫妇各获得1个健康胚胎，进行植入后其中一对夫妇已成功诞下健康婴儿，另一对夫妇成功得到妊娠，羊水穿刺显示核型分析正常。与2017年XU等[13]研究结果比较，本研究在特定区域选取了更多的SNP位点进行连锁分析，能更好地避免等位基因脱扣造成误诊的问题，令胚胎染色体单体型构建可信度更高。

本研究采用WGA结合NGS和SNP连锁分析，通过单体型的构建可推断胚胎2条DNA链的来源，从而最终确定其是否为正常胚胎。根据本研究4个胚胎的检测结果，1、2号胚胎均存在染色体异常，经构建13、14号染色体单体型，进一步进行PGD检测，鉴定1、4号胚胎均为罗氏易位携带者。由于罗氏易位衍生染色体携带者在表型上和正常核型的人并无差异[14]，往往因为其子女患有某种疾病而确诊[15]，没有发生染色体数目变异的3、4号胚胎均为可正常出生和发育成长的可移植胚胎；但罗氏易位携带者在生育时存在较高风险生出染色体异常的后代，3号胚胎由于没有携带罗氏易位衍生染色体，故为优质胚胎。最后选择核型正常且没有致病基因携带的3号胚胎进行植入，阻断了罗氏易位衍生染色体的垂直遗传，有利于优生优育。

目前，国内外均可见到NGS用于PGS/PGD的文献报道，但由于当下PGS、PGD需对胚胎细胞进行活检取样，这个过程对胚胎本身的损伤也备受争议。近年来，对PGS和PGD的部分文献还报道了其存在子代安全性[16]及后天发育的问题[17]，但目前缺乏这方面的样本积累及研究。近年来，无创胚胎染色体筛查技术已兴起，该技术应用游离在胚胎培养液中的微量DNA通过单细胞全基因扩增技术实现对胚胎染色体的全面筛查[18]，将从胚胎上提取细胞的活检形式改成从培养液中提取DNA，保留了胚胎样本的完整性。相信随着科技的进步，PGS和PGD会用于各种生殖遗传疾病方面的检测，对罗氏易位携带者的PGD技术会越来越成熟和可靠。