ADRB3基因rs9694197多态性与冠心病的关联性研究

张金宇， 向 阳， 李晓梅， 刘 芬， 赵 倩， 杨毅宁

(新疆医科大学第一附属医院1康复医学科， 2心脏中心， 3临床医学研究院科研基地科， 乌鲁木齐 830054)

流行病学研究显示，随着社会经济发展和生活水平的不断提高，冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)发病率呈上升趋势，是目前威胁人类健康的主要疾病之一，增加了巨大的医疗开支。近年来，人们对于冠心病的病因、发病机制、诊断及治疗进行更深入的研究，并取得了巨大的进步，对冠心病的认识也有了巨大的提高，认为冠心病是一种多因素疾病，其发生、发展受到多种因素的影响，包括胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病、高血压、脂质代谢紊乱及不良生活方式[1-2]。β3肾上腺素能受体(β3AR)属于G蛋白偶联受体超家族成员之一，具有7个α螺旋跨膜区构成6个环，细胞内外各3个，由402个氨基酸组成。β3AR在机体主要分布于内脏脂肪组织中，在肌肉、胆囊、胃肠道、前列腺等组织中也有少量分布，参与腺苷酸环化酶介导的一系列脂解反应和能量调节[3]，介导脂肪代谢相关反应，使之分解产生热量[4]。迄今为止，对ADRB3基因Trp64Arg单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)的研究较深入，已有多项研究表明此受体基因变异与冠心病的危险因素相关，如高血压、胰岛素抵抗、脂代谢异常及肥胖[5-10]，鉴于ADRB3基因在上述疾病的重要作用，ADRB3基因是冠心病发病的重要候选基因。国内外关于ADRB3基因rs9694197遗传多态性和冠心病之间的关系及该基因在冠心病发病中的机制尚未完全阐明，本研究探索遗传因素在冠心病发病中的可能机制，选择ADRB3基因标签SNP rs9694197进行研究，为冠心病的发病机制、干预及基因靶向治疗提供科学依据。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象选取2016年1月-2018年12月因胸痛症状在新疆医科大学第一附属医院住院行冠状动脉造影检查的患者为研究对象，根据冠状动脉造影及临床资料结果将其分为冠心病组和对照组，冠心病诊断按照世界卫生组织(WHO)关于缺血性心脏病的诊断标准，冠状动脉造影检查显示至少1支或者以上冠状动脉直径狭窄≥50%，并结合冠心病临床表现、症状及体征、心电图的动态演变及相关实验室检查结果，共纳入600例冠心病患者。对照组无冠心病家族史，并经体格检查、心脏超声检查及心电图检查及冠状动脉造影检查确定没有冠心病的患者493例。本研究的排除标准：已接受冠状动脉再血管化治疗、心肺复苏后、原发性心肌病或结构性心脏病、严重肝肾功能不全、恶性肿瘤以及临床资料不全、不同意纳入本研究等。

1.2 血液标本采集、生化指标检测及DNA提取使用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管留存所有患者空腹12 h以上的肘静脉血液5 mL，研究对象的生化指标由新疆医科大学第一附属医院医学检验中心统检测。室温下以1 000 r/min离心20 min分离血浆和血细胞，采用全血基因组提取试剂盒(天根生化有限公司生产)提取患者血细胞DNA，通过Nanodrop ND-2000超微量核酸仪对DNA的纯度和浓度进行质量控制，纯度保证其A260∶A280比值在1.8以上，使用前进行DNA浓度滴定，将DNA浓度稀释并将其统一调至50 ng/μL，置于-80℃冰箱备用待基因分型使用。

1.3 标签SNP的选择运用Haploview4.2软件选择标签 SNP rs9694197，设定最小等位基因频率(minor allele frequence，MAF)≥0.05，r2≥0.80，见图1。

图1 运用Haploview4.2软件选择 ADRB3基因标签SNP(rs9694197)

1.4 基因分型采用Taqman 法检测SNP rs9694197基因型，在ABI 7900HT型实时荧光定量PCR仪上进行，使用SDSv2.4版本的终点分型软件包进行自动基因分型，结果如图 2 所示，3种颜色分别代表不同基因型。

图2 Taqman 基因分型结果读取示意图

2 结果

2.1 病例组和对照组2组一般资料的比较病例组和对照组在性别、年龄构成上差异无统计学意义 (P>0.05)。病例组和对照组身高、体质量、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇无差异(P>0.05)，病例组甘油三酯、高血压、糖尿病、吸烟高于对照组，差异有统计学意义 (P<0.05)，对照组饮酒高于病例组，差异有统计学意义 (P<0.05)，见表1。

表1 病例组和对照组2组一般资料比较

注：TG：甘油三酯；TC：总胆固醇；HDL-C：高密度脂蛋白胆固醇；LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇。

2.2 Hardy-Weinberg平衡检验ADRB3基因rs9694197基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡，P>0.05，具有群体代表性。

2.3 病例组和对照组2组基因型和等位基因频率分布对于rs9694197，2组均以AA型为主，等位基因频率均以A为主，rs9694197三种基因型在病例组人群中的分布频率分别为：AA型占67.1%，AG型占29.2%，GG型占3.7%；在对照组人群中的分布频率分别为：AA型占67.8%，AG型占31.0%, GG型占1.2%, GG基因型在病例组中的分布频率明显高于对照组，2组基因型分布差异具有统计学意义(P=0.036)。rs9694197位点A、G等位基因在病例组人群中的分布频率分别为：A等位基因:81.7%，G等位基因:18.3%，在对照组人群中的分布频率分别为：A等位基因:83.3%，G等位基因:16.7%, 2组等位基因分布差异无统计学意义(P=0.354)，见表2。

表2 病例组、对照组2组rs9694197基因型及等位基因分布频率比较/例(%)

2.4 多因素非条件Logistic逐步回归分析将是否为冠心病作为因变量，性别(1=男性，2=女性)、年龄(岁)、身高(cm)、体质量(kg)、甘油三脂(mmol/L)、总胆固醇(mmol/L)、高密度脂蛋白胆固醇(mmol/L)、低密度脂蛋白胆固醇(mmol/L)、高血压(0=未患高血压，1=患高血压)、糖尿病(0=未患糖尿病，1=患糖尿病)、吸烟(0=不吸烟，1=吸烟)、饮酒(0=不饮酒，1=饮酒)及ADRB3 rs9694197多态性为自变量，rs9694197基因多态性仍然和冠心病的发病风险相关，在病例组中，携带GG基因型者患冠心病风险是AA基因型的3.582倍(OR=3.582，95%CI=1.216～10.558，P=0.021)，LDL-C(OR=1.352，95%CI=1.001～1.824，P=0.049)、糖尿病(OR=2.326，95%CI=1.539～3.516，P<0.001)和吸烟(OR=3.897，95%CI=2.428～6.256，P<0.001)是冠心病的危险因素，见表3。

表3 ADRB3基因rs9694197多态性与冠心病风险性的关系

3 讨论

冠心病病因和发病机制可能由于是个体的遗传易感基因和多个环境因素共同作用的结果，它的遗传基础不仅是一对等位基因，而是多对等位基因，这些等位基因的相互作用促成了冠心病易感性的个体差异[11]。β3AR是一种蛋白质，是交感神经系统的重要组成部分，其结构包括细胞外区域、跨膜区和细胞内区域，人体内的儿茶酚胺类物质可与β3AR结合，与线粒体上的 Gs蛋白偶联，使腺苷酸环化酶激活，催化三磷酸腺苷转化为环磷酸腺苷，使L型钙通道磷酸化，促进钙离子由胞外向胞内转运，进而促进机体内脂肪酸磷酸化和氧化，对机体脂肪分解和产热过程起关键作用[12-13]。人类ADRB3基因位于8号染色体，位于8p11.1-8p12，包括2个外显子和1个内含子，ADRB3 基因在人群中呈多态性表达，当ADRB3基因发生突变时，可能会引起β3AR结构及功能改变，影响机体脂质代谢过程，导致患高血压、糖尿病以及肥胖风险升高[14-15]。基于标签SNP策略，本研究选择了该基因rs9694197，该位点位于基因3’侧翼区，不影响mRNA和蛋白的结构功能，但是可能影响表达量。在本研究中，单因素分析显示病例组和对照组2组之间年龄相匹配，在多因素分析时，年龄显示出统计学意义，但OR值为1.059，约等于1，表示该因素对疾病的发生不起作用。本研究在多因素分析中，以AA基因型为参照，AG基因型OR<1，为保护性因素，但差异无统计学意义(P=0.482)，GG基因型OR为3.582(P=0.021)，ADRB3基因多态性rs9694197在冠心病和非冠心病患者之间的分布频率差异有统计学意义，携带GG基因型者患冠心病风险高于AA基因型携带者，后续我们可扩大样本量进行进一步的验证。由此我们通过ADRB3基因多态性检测，可能预知患者是否具有患冠心病风险性较高的基因型，从而采取有针对性的措施来控制和调节ADRB3基因的表达，从而达到个体化治疗的目的。由于冠心病是复杂多基因遗传性疾病，本研究采用单一基因研究具有一定局限性，单一的基因效应往往容易被其他冠心病的相关危险因素所掩盖。对于一种新的候选基因，要阐明其结构与功能以及临床疾病之间的相互关系，是目前分子生物学领域中具有挑战性的工作，因此后续工作可以在分子水平上探索ADRB3基因表达及编码蛋白质的功能，检测β3AR水平的变化，以期为冠心病的发病机制及早期临床干预提供理论依据打下基础。