复合菌株对采后芒果品质和抗病性的影响

葛念念，周 易，田亚琴，邵远志*

（海南大学食品学院，海南 海口 570228）

芒果是著名的热带水果之一，因果肉细腻、风味独特，素有“热带果王”之称，食用芒果具有美化肌肤、预防高血压和动脉硬化、防止便秘、止咳、清肠胃的功效，深受人们喜爱。芒果以其味美、质优、营养丰富而闻名天下，其含有丰富的糖、蛋白质、粗纤维及维生素。芒果是我国海南、广东、广西等多个地区重要的经济作物之一。但采后病害常会引起芒果大批量的腐烂变质，造成巨大的经济损失。生物防治是近十年来研究最热、突破性最大的一种控制果蔬采后病害的方法[1]。生物防治方法主要有诱导抗病性、植物源抑菌物质和拮抗微生物。自2000年以来，国内外对微生物诱导果蔬抗病性的研究越来越关注。Anitha等[2]研究表明，将荧光假单胞菌、木霉菌和水杨酸混合后使用能有效增强水稻对纹枯病菌的抗病性；范三红等[3]用拮抗细菌洋葱霍尔德氏菌处理采后玫瑰香葡萄后，发现葡萄的抗病性相关酶活性有所提高。井敏敏等[4]的研究结果也表明微生物对采后芒果果实的过氧化物酶（peroxidas，POD）、苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine amonialyase，PAL）、β-1,3-葡聚糖酶（β-1,3-glucanase，GLU）等酶活性具有一定的诱导作用，同时还能维持采后芒果的贮藏品质。生物防治微生物诱导果实抗性具有无毒、环保、无残留等优点，已广泛应用于果蔬采前、采后病害的防治。增强微生物诱导果实抗性、维持果实品质的效力是当下研究热点。

在采后果蔬的生物防治领域，将不同拮抗菌混合或将拮抗菌与其他物质结合使用是增强拮抗菌生物防治效力的重要手段之一[5-8]。但菌株混合使用对诱导果蔬抗性效力影响的报道较少。本实验以实验室前期获得的对采后芒果抗性相关酶具有有益影响的3 种菌株为研究对象[9-11]，评估3 种菌株混合使用对芒果品质和抗病性的影响，旨在筛选出一种或多种有效的复合菌剂用于商业化生产。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

芒果果实采自海南省昌江县芒果园，以七成熟、无病虫害、大小一致的‘台农’芒果为实验对象。

汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii，Y-1）、2.3511号尼泊尔德巴利酵母（Debaryomyces nepalensis，T18）、萎缩芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus，TE-7）由本实验室前期分离筛选鉴定所得；芒果胶胞炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所提供。

L-苯丙氨酸、氮蓝四唑、愈创木酚、领苯二酚、3,5-二硝基水杨酸等均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

CM-700d手持分光测色仪 日本柯尼卡美能达公司；FHM-1硬度计、N-1α手持折光仪 日本Atago公司；UV-1800紫外-可见光分光光度计 岛津企业管理（中国）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 孢子萌发抑制实验

孢子萌发率的测定参照刘星雨[12]的方法并稍加修改。取7 支10 mL离心管，分别加入5 mL 108CFU/mL的TE-7、T18、Y-1、T18＋Y-1、Y-1＋TE-7、T18＋TE-7菌悬液和无菌蒸馏水（对照），其中各混合菌液中，两种菌液的体积比均为1∶1。再依次加入用无菌蒸馏水配制的100 μL 105CFU/mL芒果胶胞炭疽病孢子悬浮液，置于25 ℃培养箱培养，分别在5 h和8 h后用显微镜观察孢子萌发情况，实验重复3 次。

1.3.2 原料处理

挑选七成熟、大小一致、无病虫害的台农芒果，修剪果柄至5 mm左右，用自来水洗去污渍后置于体积分数2%的次氯酸钠溶液中浸泡2 min，再用自来水将果实冲洗干净，晾干后将果实分为7 组，分别用无菌蒸馏水和108CFU/mL的TE-7、T18、Y-1、T18＋Y-1、Y-1＋TE-7、T18＋TE-7菌悬液浸泡果实20 min，室温下晾干。处理后的果实置于25 ℃、相对湿度90%的恒温恒湿培养箱中。贮藏21 d后测定病情指数；品质指标每3 d进行一次取样测定。

1.3.3 病情指数的测定

将各处理组的芒果按果实表面病斑的面积所占果实表面积的比例进行分级：0级（没有病斑）、1级（病斑面积＜1/10）、2级（病斑面积占1/10～1/5）、3级（病变面积占1/5～1/2）、4级（病斑面积＞1/2）。每个处理20 个果实，实验重复3 次。病情指数按下式计算。

1.3.4 品质指标的测定

芒果色泽（红度a*值）采用分光测色计测定；硬度用FHM-1果实硬度计进行测定；可滴定酸（titratable acid，TA）质量分数采用碱中和滴定法测定；总可溶性固形物（total soluble solids，TSS）质量分数采用N-1α手持折光仪测定[13]。以上各指标测定每组处理测3 个果实，每个果实重复测3 次。

1.3.5 PPO、POD、GLU、PAL活力的测定

多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活力测定采用邻苯二酚法[14]。取2 g经液氮处理的芒果样品，加入预冷的5 mL100 mmol/L乙酸-乙酸钠缓冲液（pH 7.5，含1 mmol/L聚乙二醇6000、40 mg/mL PVP和10 mg/mL TritonX-100）后，用研钵进行冰浴研磨。研磨获得的酶提取物在4 ℃下以15 000hg离心20 min，取上清液制备反应体系。反应体系平衡1 min后连续测定在398 nm波长处吸光度的上升段。以1 mg/mL邻苯二酚溶液作为对照，以1 min内398 nm波长处吸光度上升0.01为1 个酶活力单位（U）。单位为U/（ggmin），结果以鲜质量计。每组处理测定3 个果实，每个果实提取的样液重复3 次。

POD活力参照王学奎[15]的方法测定。取2 g经液氮处理的芒果样品，加入预冷的5 mL 100 mmol/L乙酸-乙酸钠缓冲液（pH 7.5，含1 mmol/L聚乙二醇6000、40 mg/mL PVP和10 mg/mL TritonX-100）后，用研钵进行冰浴研磨。研磨获得的酶提取物在4 ℃下以15 000hg离心20 min，取上清液制备反应体系。以1 min内470 nm波长处吸光度上升0.01为1 个酶活力单位。单位为U/（ggmin），结果以鲜质量计。每组处理测定3 个果实，每个果实提取的样液重复3 次。

GLU活力测定参照Ippolito等[16]的方法稍加修改，通过测量从底物释放的还原糖的量来测定。取2 g经液氮处理的芒果样品，加入预冷的5 mL 50 mmol/L乙酸钠缓冲液（pH 5.2，含有1 mmol/L乙二胺四乙酸、5 mmol/L β-巯基乙醇和1 g/L L-抗坏血酸），用研钵进行冰浴研磨获得酶提取物。酶提取物在4 ℃下透析12 h，然后12 ℃、12 000hg离心20 min，取上清液制备反应体系。反应体系于540 nm波长处测定吸光度，以每秒每克鲜果实组织与昆布多糖反应生成1 nmol葡萄糖为1 个酶活力单位（U），酶单位以U/（ggs）表示。蒸馏水代替酶液作为空白对照。每组处理测定3 个果实，每个果实提取的样液重复3 次。

PAL活力测定参考曹建康等[17]方法，稍加修改。取2 g经液氮处理的芒果样品，加入预冷的5 mL 100 mmol/L硼酸缓冲液（pH 8.8，含40 g/L PVP、2 mmol/L乙二胺四乙酸和5 mmol/L β-巯基乙醇），用研钵进行冰浴研磨。研磨获得的酶提取物在4 ℃下15 000hg离心20 min，取上清液制备反应体系。反应体系于290 nm波长处测定吸光度，以每小时每克鲜果酶促反应体系吸光度增加0.01作为1 个酶活力单位，单位为U/（ggmin）。每组处理测定3 个果实，每个果实提取的样液重复3 次。

1.4 数据处理与分析

数据采用Excel软件处理，Origin Pro 8.0软件绘图。使用SPSS 16.0软件通过单因素方差分析（analysis of variance，ANOVA）进行差异显著性比较，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同处理对炭疽菌孢子萌发的影响

如表1所示，处理5 h后所有菌液对炭疽病病原菌孢子的相对抑制率为100%。与对照相比，各菌液处理均能有效抑制病原菌孢子的萌发。8 h后，Y-1＋TE-7处理组的孢子萌发率最低，仅为17.56%，分别是单一处理组Y-1、TE-7的36%、80%。说明Y-1和TE-7组合后提高了单一处理对炭疽菌孢子萌发的抑制率。

表1 不同处理对培养不同时间炭疽菌孢子萌发率的影响Table1 Effect of different treatments on spore germination of Colletotrichum gloeosporioides%

2.2 不同处理对贮藏结束时芒果病情指数的影响

图1 不同处理对贮藏结束时芒果病情指数的影响Fig.1 Effects of different treatments on disease index in mango fruit at the end of storage

如图1所示，芒果贮藏21 d时，Y-1＋TE-7处理组的病情指数仅为10.42，显著低于其他处理组（P＜0.05）。此外，与各自单一处理组相比，T18＋TE-7和T18＋Y-1组合的病情指数反而呈现略微上升的现象。

2.3 不同处理对芒果贮藏过程中品质的影响

色泽是最直观的表现果实品质变化的指标，a*值代表红绿色度。由图2A可知，贮藏前期，a*值为负，各组芒果色泽变化差异并不明显。6 d后，a*值开始呈上升趋势，且各处理组间差异明显。在第15天时，Y-1＋TE-7处理组a*值最小，仅为－7.10，与此同时，其他处理组果实皆已不呈现绿色（即转黄）。与各自单一处理组相比，Y-1＋TE-7组合能明显地抑制芒果由绿变黄的颜色，但T18＋TE-7和T18＋Y-1组合的抑制效果并不理想。

图2 不同处理对芒果贮藏期间品质的影响Fig.2 Effects of different treatments on storage quality of mango fruit

如图2B所示，与对照相比，各菌悬液处理后均能有效延缓芒果贮藏期间硬度的下降。贮藏末期，Y-1＋TE-7处理组芒果的硬度高达0.520 kg/cm2，分别是单一处理组Y-1和TE-7的1.29、1.23 倍。T18＋TE-7和T18＋Y-1虽有较理想的处理效果，但与T18单一处理相比效果并不明显。

TSS质量分数是衡量果实成熟度和品质的重要指标之一，并常用于果实的优劣分级。由图2C可知，贮藏前期（0～9 d），与单一TE-7和Y-1处理相比，Y-1＋TE-7处理能更有效地抑制TSS质量分数的上升。在第15天时，Y-1＋TE-7处理组的TSS质量分数仅达10.5%，低于其他处理组。在第18天时，处理组Y-1＋TE-7的TSS质量分数迅速达到峰值，并在贮藏末期维持较高的TSS质量分数。相比单一处理组，T18＋TE-7处理组亦能在第12～18天维持着较低的TSS质量分数。与对照相比，T18＋Y-1处理也能有效减缓TSS质量分数的上升，但其在贮藏末期出现了TSS质量分数骤减的现象。成熟后果实高TSS质量分数则表明其具有较好的品质，故Y-1与TE-7混合后有效增强了各自单一处理对芒果果实贮藏期TSS质量分数的有利影响（即贮藏前期保持较低的TSS质量分数，贮藏后期维持了较高的TSS质量分数）。

如图2D所示，各处理组芒果在贮藏期间TA质量分数差异明显。Y-1＋TE-7能够显著增强各自单一处理延缓TA质量分数下降的能力（P＜0.05）；第15天时，Y-1＋TE-7处理组的TA质量分数高达0.95%。而T18＋Y-1虽能略提高Y-1单一处理延缓芒果贮藏期TA质量分数下降的能力，但却明显削弱了T18处理延缓芒果贮藏期TA质量分数下降的能力；T18＋TE-7能有效提高Y-1单一处理延缓芒果贮藏期TA质量分数下降的能力，但其抑制能力却略低于T18单一处理组。故T18＋Y-1、T18＋TE-7均未达到预想中增强各单独处理抑制芒果果实贮藏期TA质量分数下降的效果。因此，只有Y-1和TE-7的混合在抑制芒果果实贮藏期TA质量分数下降方面表现出协同作用。

2.4 不同处理对芒果贮藏过程中相关酶活力的影响

图3 不同处理对芒果贮藏过程中相关酶活力的影响Fig.3 Effects of different treatments on GLU, POD, PAL and PPO activity in mango fruit during storage

GLU是植物抗真菌的重要抗性物质之一[18]。如图3A所示，贮藏期间，各处理组GLU活力均呈先上升后下降的趋势。6 d后，Y-1＋TE-7处理组GLU活力均显著高于其他处理组（P＜0.05），并在15 d时达到最大值（46.20 U/（ggs））。与单一T18处理组相比，T18＋Y-1、T18＋TE-7组合处理组的GLU活力下降；这表明这两种组合的菌株在诱导GLU活力方面未能获得协同的效果。

POD是多功能酶，是植物酶促防御系统的关键酶之一，它能与SOD、CAT相互协调配合，从而消除过剩的自由基、提高植物的抗逆能力[19]。如图3B所示，芒果贮藏过程中POD活力大致呈先上升后下降的趋势。贮藏6 d后，Y-1＋TE-7处理的POD活力整体高于单一处理Y-1和单一处理TE-7的POD活力。第9天时，对照组和Y-1、TE-7处理组的POD活力分别是23.42、22.56、41.01 U/（ggmin），而Y-1＋TE-7的POD活力达44.67 U/（ggmin）；在贮藏后期，TE-7处理组的POD活力开始急剧下降，而Y-1＋TE-7处理组仍维持着较高水平的POD活力。结果表明，Y-1和TE-7组合处理有助于维持芒果POD的高活力。

PAL是苯丙烷途径的关键酶，植物的抗病力越强，PAL活力越高，且高活力持续的时间也越长[20]。如图3C所示，贮藏6 d后，Y-1＋TE-7处理的PAL活力同样始终高于单一处理Y-1和单一处理TE-7的PAL活力。此外，贮藏3 d后，Y-1＋TE-7处理组的PAL活力开始持续升高，在18 d时达到峰值（174.16 U/（ggmin）），分别是此时对照组和TE-7、Y-1处理组的2.41、1.53、2.60 倍。T18＋TE-7处理组PAL活力第9天时达到第一次峰值，仅为此时TE-7处理组的65%；在第18天达到第二次峰值时，其酶活力也只达TE-7处理组的67.4%。T18＋Y-1处理组PAL活力仅略高于对照组，说明两者组合的效果不佳。因此Y-1和TE-7的组合在提高PAL活力方面表现出了较好的协同作用，从而能进一步增强果实抗病能力。

PPO是引起果蔬褐变的主要酶类，高活力的PPO会对果实品质造成不良影响。如图3D所示，贮藏期间，各处理组芒果PPO活力均大致呈上升趋势。在贮藏中期（9～18 d），Y-1＋TE-7处理的PPO活力均低于其他处理组。第6天时，T18＋Y-1、Y-1＋TE-7处理组PPO活力达到一个峰值，分别是此时对照组的1.31、1.04 倍。第18天时，T18＋Y-1、Y-1＋TE-7、T18＋TE-7处理组的PPO活力仅是对照组的79%、64%、88%。贮藏期间，除对照外，其他处理组均表现出较低的PPO活力，说明所有处理均能有效抑制PPO对芒果果实的不利影响。

3 讨 论

在抵制病原物侵染的过程中，果蔬体内的抗性相关酶发挥着重要作用[21-23]。这些酶主要包括病程相关蛋白（pathogenesis-related proteins，PRs）和苯丙烷代谢中的一些相关酶。菌株对植物自身抗病性的影响主要是通过诱导这些酶的活性来实现的[24-26]。其中POD属于PR9蛋白家族，不仅可以调节活性氧的代谢，还参与木质素和植保素的合成，从而增强植物的抗性。精氨酸处理番茄后，诱导了果实抗病防御相关酶PAL、POD、GLU和几丁质酶（chitinase，CHT）等活力的提高，促进了酚类物质的积累，同时诱导了果实PR2a、PR2b、PR3a和PR3b的表达[27]。拮抗菌膜醭毕赤酵母通过诱导草莓PAL、POD、GLU、CHT的活性，从而提高果实对灰霉病的抵抗能力[28]。本实验结果表明，与单一Y-1处理和单一TE-7处理相比，Y-1＋TE-7处理能显著提高果实的GLU、PAL、POD活力，GLU活力提高能加速其对病原菌细胞壁的水解，降低病原菌的侵染力；高活性的PAL、POD又可通过调节苯丙烷途径增加木质素、酚类、植保素等抗性物质的合成；以上说明，相比单一Y-1处理和单一TE-7处理，Y-1＋TE-7组合处理更好地诱导了芒果果实的局部抗性。这一结果也与Calvo等[29]发现应用两种不同的微生物可降低这两种微生物的变异性并改善两者单独应用时的作用效力的观点相一致。

能反映芒果成熟的相关生理指标有很多，如色泽由绿转黄、硬度由硬变软、TSS质量分数升高和TA质量分数降低等。本实验结果表明，与单一Y-1和TE-7处理相比，Y-1＋TE-7处理更能延缓芒果TA质量分数、硬度指标的下降，抑制TSS质量分数的升高和色泽转黄，同时维持芒果POD较高的活力，能有效消除果实贮藏后期氧胁迫对菌株及果实本身的不利影响；这一结果与罗世杏等[30]发现的SOD、POD的活力与芒果成熟度呈极显著负相关（P＜0.01）的结果一致。另有研究表明，成熟度低的果实具有更高的抗病能力[31-32]。本实验也发现，对同一成熟度的芒果果实进行不同浸泡处理后，Y-1＋TE-7处理组的果实在贮藏期间表现出了更低的成熟度及更高的抗病性，说明Y-1＋TE-7处理可延缓芒果果实衰老，增强其抗病能力。而其他两种组合（T18＋Y-1、T18＋TE-7）的作用效果并不明显，甚至在有些指标上会表现出削弱单一T18处理的作用效力的现象，这与Stockwell等[33]描述的不同菌株混合后出现的机械不相容的现象相似。

总地来说，Y-1＋TE-7处理对芒果胶胞炭疽病的孢子萌发有明显抑制效果。同时，Y-1＋TE-7处理可有效增强各单一处理延缓果实成熟衰老和诱导POD、PAL、GLU活性的能力，能显著提高芒果果实的贮藏品质并进一步增强果实的抗病性。由此可见，Y-1＋TE-7处理对采后芒果有良好的保鲜效果，并具有潜在的应用价值。