原花青素B2对D-半乳糖模型小鼠肠道菌群的影响

訾雨歌，徐 越，肖 瀛*，吴其国，尹志婷，周一鸣，周小理

（上海应用技术大学香料香精技术与工程学院，上海 201418）

机体生长发育到成熟阶段后，其组织器官和生理功能就会随年龄的增长出现衰退，机体出现全身性退化性行为的现象称为衰老[1]。衰老是生命体发展过程的必经阶段，不可抗拒，其会从生理和心理多方面降低人的生活质量。当人们进入到衰老期，肠道的屏障、吸收及免疫功能都会发生改变，加上各种外因（饮食习惯改变、疾病药物的使用、营养摄入平衡等）的影响[2-4]，可导致肠道微生态平衡的破坏。人体肠道微生物基因是最为复杂的，其中栖息着复杂且数量庞大的肠道菌群，细菌的总数比人体细胞总数多10 倍，其种类有100 种以上[5]。菌群影响着营养物质吸收与代谢，在调节人体免疫和预防疾病等方面显著影响着机体健康[6]。随着年龄的增长，人体肠道菌群会发生质和量的变化，导致人体菌群出现老化的现象。

原花青素B2作为一种高效的天然抗氧化剂，不仅可以清除体内过多的自由基，还能抑制脂质过氧化的发生，发挥维持体内自由基与抗氧化酶之间稳态的作用，从而预防自由基引起的相关疾病[7]。不可否认的是，原花青素在体内的代谢吸收对其功能的发挥至关重要[8]。原花青素的消化吸收主要发生在小肠部位，但其利用率较低[9]，未吸收的多酚可进入结肠影响肠道菌群结构。原花青素B2影响肠道微生物可能是发挥其功能活性作用的重要途径之一。因此，本研究采用D-半乳糖诱导衰老模型小鼠，通过Illumina MiSeq高通量测序平台对小鼠粪便样本中细菌16S rRNA V4区进行定性分析，解析衰老小鼠肠道菌群的变化，探索原花青素B2抑制小鼠衰老与肠道菌群改变间的关系及可能机理。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

雄性4 周龄C 5 7 B L/6小鼠3 0 只，体质量为（15f2）g，购买于上海灵畅生物科技公司（许可证号：SCXK（沪）2013-0018）。将小鼠饲养在室温为（22f2）℃、12 h昼夜交替的动物房内，自由摄食和饮水，1 周后随机分为3 组，每组10 只，分2 笼饲养，分别为对照组、衰老组、原花青素B2组。实验周期为7 周，每天按照0.1 mL/10 g的剂量给衰老组与原花青素组小鼠皮下（颈部）注射质量分数5% D-半乳糖，对照组小鼠注射等剂量的生理盐水，并根据小鼠体质量的变化调整剂量。对照组与衰老组小鼠饲喂标准饲料AIN93G，原花青素组小鼠饲喂原花青素B2干预饲料（AIN93G＋质量分数0.2%原花青素B2）。

D-半乳糖、肝素钠（分析纯） 上海阿拉丁生化科技公司；原花青素B2（纯度≥90%） 上海同田生物技术有限公司；无水乙醇、乙醚（分析纯）国药集团上海化学试剂公司；总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）试剂盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒、过氧化氢酶（catalase，CAT）试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-PX）试剂盒、丙二醛（lipid peroxidation，MDA）试剂盒 南京建成生物研究所；QIAamp DNA Stool Mini Kit 德国Qiagen公司；荧光定量试剂SYBR Premix Ex Taq、DNA纯化试剂盒、D2000 DNA Marker 天根生化科技公司。

1.2 仪器与设备

DF-1156型低温冰箱 日本三洋电机公司；3k-18型离心机 德国Sigma公司；PURELAB Classic型超纯水机 英国ELGA公司；GeneAmp®9700型聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪 美国ABI公司；TQ8040气相色谱-质谱联用仪（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS） 日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 样品采集

实验最后一周早晨，采集小鼠的新鲜粪便约0.1 g于灭菌试管中，－80 ℃冻存待测；另取0.2 g置于灭菌试管中冻存待测。乙醚麻醉后颈椎脱臼法将小鼠处死并迅速打开腹腔，取出十二指肠和结肠，在冰浴条件下用生理盐水匀浆，制成质量分数10%组织匀浆液，4 ℃、5 000 r/min离心10 min取上清液，保存于－80 ℃待测。

1.3.2 抗氧化指标测定

取1.3.1节匀浆好的上清液，按照试剂盒说明书测定T-AOC、SOD及CAT活力和MDA含量。

1.3.3 粪便DNA提取及测序

称取200 mg粪便于2 mL离心管中，按试剂盒说明书提取DNA，将DNA样品送至上海美吉生物科技公司进行16S rDNA测序。

1.3.4 SCFAs含量测定

称取0.1 g粪便样品置于2 mL离心管中，加入500 μL饱和NaCl溶液，打碎均质至无明显块状物后加入20 μL硫酸溶液（由0.5 mL浓硫酸和5 mL水混合配制）酸化，漩涡振荡30 s，加入800 μL无水乙醚以萃取短链脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）。将溶液漩涡振荡30 s，14 000 r/min离心15 min后吸取上清液，将上清液加到装有0.25 g无水硫酸钠的2 mL离心管中，再次以同样条件离心，以除去上清液中残留的水分，转入GC样品瓶。

GC条件：载气为He；分流比为10∶1；流速为2.0 mL/min；升温程序为7.5 ℃/min从100 ℃上升至140 ℃，保持4 min；60 ℃/min升温至200 ℃。柱箱温度100 ℃，进样口温度240 ℃，离子源温度220 ℃，接口温度250 ℃，溶剂延迟时间0.5 min。MS采集时间1.5～9.5 min，采集方式为Q3 Scan，m/z范围是20.00～300.00，进样量为1 μL，每个样品检测时间均为23.58 min。

1.4 数据统计与分析

数据采用fs表示，并采用SPSS 11.5软件中的方差分析方法进行显著性分析，P＜0.05为差异显著。对Illumina MiSeq测序的质量进行质控和过滤，区分样本后进行运算分类单位（operational taxonomic unit，OTU）聚类分析和物种分类学分析，基于OTU对测序进行多种多样性指数分析以及深度检测；基于分类学信息在各个分类水平上进行群落结构的统计分析。在上述分析的基础上，对多样本的群落组成和系统发育信息进行多元分析和差异显著性检验等一系列深入的统计学和可视化分析。

2 结果与分析

2.1 原花青素B2对小鼠体质量及抗氧化指标的影响

在一定程度上，小鼠体质量变化能反映小鼠的生长发育情况[10]。如图1所示，前3 周小鼠体质量增长较快，从第4周开始小鼠体质量增长的速度下降；与对照组小鼠比较，衰老组小鼠体质量有所减轻，原花青素B2组小鼠体质量有所增大，这表明D-半乳糖抑制了小鼠正常生长，原花青素B2对D-半乳糖造成衰老小鼠体质量降低有所改善。

图1 原花青素B2对小鼠体质量的影响Fig.1 Effect of procyanidin B2 on body mass in aging mice

表1 原花青素B2对衰老小鼠抗氧化指标的影响Table1 Effect of procyanidin B2 on antioxidant indices of aging mice

从表1可知，与对照组比较，衰老小鼠的十二指肠中SOD、CAT活力和T-AOC与对照组没有显著差异，但均有下降趋势；结肠中T-AOC和SOD活力同样与对照组差异不显著，但CAT活力显著下降。衰老小鼠十二指肠与结肠组织的MDA含量均显著上升（P＜0.05）。与衰老组比较，原花青素组小鼠十二指肠中T-AOC、SOD和CAT活力都显著升高（P＜0.05）；在结肠组织中SOD和CAT活力显著上升（P＜0.05），但T-AOC差异不显著。这表明原花青素B2可以提高衰老小鼠十二指肠和结肠组织的抗氧化能力，清除体内过多的自由基，抑制脂质过氧化，降低MDA 含量。

2.2 原花青素B2对小鼠肠道菌群多样性的影响

图2 小鼠肠道微生物多样性指数Fig.2 Diversity index of gut microf l ora in mice

为探究3 组小鼠肠道菌群之间的相关性，本研究采用RDP classif i er贝叶斯算法计算在97%相似水平的OTU数量，发现对照组的OTU数量为229 个，衰老组的OTU数量为233 个，原花青素的OTU数量为230 个。3 组共有的OTU数为212 个，对照组与衰老组共有但原花青素B2组没有的OTU数量是5 个，衰老组与原花青素B2组共有但对照组没有的OTU数量是11 个。如图2所示，衰老组的Alpha多样性Shannon指数极显著高于原花青素B2组（P＜0.01）。

图3 小鼠肠道微生物多样性的主成分分析Fig.3 Principal component analysis of the diversity of gut microf l ora in mice

如图3所示，基于OTU水平利用主成分分析进行分类。衰老组样本与对照组样本相距较远，表明D-半乳糖对小鼠肠道菌群组成及结构影响较明显。原花青素B2组与对照组相距较近，表明原花青素B2干预的小鼠肠道菌群结构与对照组相似。

图4 小鼠肠道菌群门水平相对丰度Fig.4 Abundance of dominant intestinal bacterial phyla in mice

如图4所示，对照组、衰老组、原花青素B2组小鼠的肠道菌群门水平都以Bacteroidetes和Firmicutes为主，其相对丰度分别为63.78%和22.67%、44.19%和44.81%、60.34%和33.96%。

如图5所示，3 组小鼠的肠道菌群属水平组成如下：对照组小鼠的粪便中包含norank-f-Bacteroidales-s24-7、Bifidobacterium、Bacteroides、Lactobacillus等多个属，还有11.22%的其他菌属。衰老组小鼠的粪便中主要包含norank-f-Bacteroidales-s24-7、Ruminiclostriduim、Bacteroides、Bifidobacterium、Blautia、unclassified-Lachnospiraeae等菌属。原花青素B2组样品主要包括norank-f-Bacteroidales-s24-7、Bacteroides、Bif i dobacterium、Blautia、unclassif i ed-Lachnospiraeae等菌属。

图5 小鼠肠道菌群属水平相对丰度Fig.5 Abundance of dominant intestinal bacterial genus in mice

2.3 原花青素B2对小鼠肠道差异菌群的影响

图6 原花青素B2对小鼠肠道B/F值的影响Fig.6 Effect of procyanidins B2 on B/F ratio in mice

如图6所示，在门水平上，与对照组相比，衰老组小鼠的B/F值（拟杆菌门与厚壁杆菌门数量比值）显著降低。与衰老组相比，原花青素B2组的B/F值显著上升。进一步比较3 组小鼠肠道菌群的差异性，分析差异性菌属，如图7所示，发现7 种存在显著差异的菌属：norank-f-Bacteroidales-s24-7、Bacteroides、Blautia、unclassified-Lachnospiraeae、Ruminiclostridium、Lachnospiraeae-NK4A136、Roseburia。相比于对照组，衰老组小鼠norank-f-Bacteroidales-s24-7的相对丰度显著降低，而其他菌属的相对丰度显著上升。与衰老组相比，原花青素B2组小鼠中norank-f-Bacteroidales-s24-7、Roseburia、Lachnospiraeae-NK4A136和Bacteroides菌属的相对丰度显著上升，而Blautia、unclassified-Lachnospiraeae和Ruminiclostridium的相对丰度显著降低。

图7 小鼠肠道微生物差异性菌属Fig.7 Differential genus of gut microf l ora in mice

2.4 原花青素B2对小鼠粪便中SCFAs含量的影响

表2 原花青素B2对小鼠粪便中SCFAs含量的影响Table2 Effect of procyanidin B2 on SCFAs contents in feces of mice

如表2所示，衰老组乙酸、丙酸、丁酸、总酸的含量均显著低于对照组（P＜0.05），在经过原花青素B2干预后，小鼠粪便中各SCFAs含量显著高于对照组与衰老组，这表明原花青素B2可调节产SCFAs菌群的丰度。

3 讨 论

本研究发现原花青素干预的衰老模型小鼠肠道的T-AOC和SOD、CAT活力都显著增加。当机体发生衰老时，体内自由基动态平衡失衡，会发生如脂质过氧化、蛋白质氧化、DNA突变等现象，从而产生氧化应激，导致相关疾病的发生[11-13]。原花青素B2具有多个酚羟基，能有效地清除衰老小鼠体内过多的超氧自由基、过氧化氢及过氧化物，抑制脂质过氧化产物堆积，从而延缓机体衰老进程。

肠道菌群是由种类繁多的大量微生物组成的庞大复杂的生态系统，与宿主的生长、发育、物质代谢和衰老有着密切的关系[14]。但如果机体内的自由基动态平衡失调，过量的自由基会引起肠黏膜损伤，使机体遭受致病菌侵染[15-16]。本研究发现饲喂原花青素饲料后，小鼠肠道优势菌群为Bacteroidetes和Firmicutes这两个细菌门，同时B/F值也显著上升，与Bezirtzoglou等[17]的研究结果一致。Bacteroidetes可以分解植物中的糖类物质，使其转化为对身体有益的产物[18-19]。同时，在原花青素干预后，衰老小鼠体内Bacteroides的相对丰度显著提高，与对照组没有显著差异，这与Ley等[20-21]的研究结果一致，表明原花青素B2可调节衰老小鼠肠道中Bacteroidetes和Firmicutes的相对丰度，调整肠道菌群结构，从而延缓衰老进程。

本研究发现原花青素B2干预的衰老模型小鼠Roseburia和Lachnospiracea属的相对丰度均显著上升，其中Roseburia是一类在结肠代谢产生丁酸的革兰氏阳性菌，其可以发酵葡萄糖产生乳酸及少量乙酸[22]。据报道，身体虚弱的老年人[23]、结直肠癌患者[24]以及肝硬化患者[25]的粪便中丁酸盐产生菌显著减少。王芳[25]通过Illumina MiSeq测序分析发现百岁老人肠道中球状梭菌类群的Roseburia属相对丰度显著增加，Zhao Liang等[26]也得到同样的结果。unclassif i ed-Lachnospiraeae是厚壁菌门中产生丁酸盐的重要类群，丁酸被证实能够减轻肠炎对黏膜的损伤[27]，并且能够缓解衰老导致的肠道炎症[28-30]。原花青素B2干预后，衰老小鼠体内SCFAs含量显著上升。SCFAs尤其是丁酸能通过影响白细胞黏附分子的表达而起到抗炎作用，同时，SCFAs可保护黏膜细胞的正常功能，减少有毒物质的吸收，增加细胞活性，延缓衰老[31-33]。原花青素可促进小鼠肠道代谢产生SCFAs，调节肠道pH值，维持肠道内环境稳定，进而改善衰老机体肠道菌群的平衡状态，具有延缓衰老的作用。

本研究结果表明原花青素B2可以增强衰老小鼠肠道抗氧化活性，调节肠道菌群结构，一定程度上增加了产生丁酸类有益菌的相对丰度，促进SCFAs产生，维持肠道平衡，进而延缓衰老进程。