超保守RNA uc. 189在大肠癌组织中的表达及临床病理意义

邓 慧, 李鑫雨, 吴燕丹, 王成海, 3

(1. 扬州大学医学院(转化医学研究院), 江苏 扬州, 225009; 2. 扬州大学医学院附属扬州洪泉医院 病理科, 江苏 江都, 225200; 3. 江苏省中西医结合老年病防治重点实验室, 江苏 扬州, 225009)

大肠癌是成年人消化系统最为常见的恶性肿瘤之一，多见于肥胖患者，包括结肠癌和直肠癌。在大肠癌的病理学分型中，腺癌占绝大多数，而鳞癌发生比例较低，常位于直肠肛门附近。超保守RNA(UCR)是一群绝对高度保守的长链非编码RNA, 广泛存在于不同生物物种中，如人、兔、鼠类等生物[1-3]。有趣的是，虽然生物物种不一样，但所携带的超保守RNA基因序列却高度一致。目前有许多研究[4-6]表明，超保守RNA参与了诸多生物学功能，影响正常细胞或肿瘤细胞的增殖、细胞周期、细胞凋亡和侵袭转移。本研究采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测超保守RNA uc.189在大肠癌及相应的癌旁正常组织中的表达水平，分析uc.189的RNA表达水平与大肠癌病理参数的相关性，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 临床资料

130例大肠癌及配对的癌旁正常组织标本均来源于扬州大学附属医院普外科手术患者，采集时间为 2017年1月—2018年12月，患者年龄35～72岁，中位年龄为58岁; 男79例，女51例。所有患者手术前未经过放疗、化疗等处理。标本采集、使用及临床资料的整理均经扬州大学附属医院伦理委员会批准，并与患者签署知情同意书。新鲜大肠癌组织采集后立即放入液氮罐里，于-80 ℃冰箱内长期保存。病理组织学类型包括腺癌122例，鳞状细胞癌8例; TNM分期包括Ⅰ期10例, ⅡA期16例, ⅡB期27例, ⅢA期46例, ⅢB期26例, Ⅳ期5例。

1.2 引物设计与合成

uc.189与内参U6的PCR引物序列由本实验组设计提供，引物序列的合成购自上海生工生物工程有限公司。引物序列如下: uc.189-上游引物: 5′-CAGAGTCACCATCATGTCTC-3′; uc.189-下游引物: 5′-AAGGCTGCTGCTGTAGTTGT-3′; U6-上游引物: 5′-GCTTCGGCAGCACATATACT-3′; U6-上游引物: 5′- CGCTTCACGAATTTGCGTGT-3′。

1.3 样本总RNA萃取

步骤如下: ① 首先取0.10～0.15 g新鲜肿瘤组织，放置在预冷的研钵里研磨成细粉状。② 将细粉样组织加入至含有1 mL TRizol的离心管中。③ 室温下用力振荡15 min, 使组织充分裂解，静止数秒。④ 4 ℃离心10 min, 转速12 000转/min。⑤ 将上一步的上清液迅速加入200 μL氯仿，快速振荡120 s, 并在室温下不断振荡约5 min, 静置120 s。⑥ 4 ℃离心10 min, 转速12 000转/min。⑦ 将上一步上清液迅速加入500 μL 异丙醇后置于新的离心管内，缓慢颠倒离心管并沉淀20 min。⑧ 4 ℃离心10 min, 转速12 000转/min, 弃上清液。⑨ 在离心固态物质中加入1 mL 75%酒精并缓慢颠倒弃上清，再加入1 mL 75%酒精使沉淀物质悬浮, 4 ℃离心5 min, 转速10 000转/min, 弃上清。⑩ 自然干燥2 min, 加入10 μL经焦碳酸二乙酯(DEPC) 处理的双蒸水溶解。总RNA提取后检测光密度OD值，记录后放置于-80 ℃冰箱保存。

1.4 cDNA合成

购买并使用Takara生物工程公司逆转录反应试剂盒获取cDNA。反应体系共20 μL, RNA约50 ng, 5×PrimeScript Buffer 4 μL, PrimeScript RT EnzymeMix I 1 μL, 上下游引物各0.5 μL, 添加RNase-Free water 调整体系至20 μL。反应条件37 ℃ 15 min, 85 ℃ 5 s, 反应产物保存于4 ℃冰箱。

1.5 qRT-PCR

购买并使用Takara生物公司qRT-PCR反应试剂盒，反应体系为20 μL。cDNA为1 μL, 12×SYBR Premix ExTaqTMII 10 μL, 上下游引物各0.5 μL, 加RNase-Free water调整体系至20 μL, 每组样本有3个复孔, U6设置为内参; 具体实验操作在Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR system仪器上进行。最后读取定量PCR反应Ct值，计算2-ΔΔCt(ΔCt=Ct(uc.189)-Ct(U6), uc.189的相对表达量以2-ΔΔCt计)。

1.6 统计学分析

采用GraphPad Prism 5.0统计分析及作图软件进行相关分析。以均数±标准差表示两样本间的差异，采用单因素方差分析比较uc.189在不同临床病理特征中的表达差异。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 uc.189在大肠癌组织中的相对表达

qRT-PCR实验结果表明, 130例大肠癌组织中uc.189的表达为(3.323±1.304), 高于癌旁正常大肠组织中的(1.020±0.685), 差异有统计学意义(t=21.648，P<0.05)。见图1。

与癌旁正常肠组织比较, ∗P<0.05图1 uc.189在大肠癌中的相对表达

2.2 uc.189在大肠癌组织中的表达与临床病理特征的关系

在130例大肠癌组织中, uc.189高表达者112例(RNA相对表达量>1), 低表达或正常表达者18例(RNA相对表达量≤1), 而uc.189表达与肿瘤分化程度、淋巴结转移和肿瘤TNM分期均有显著相关性(P<0.05), 与年龄、性别、肿瘤大小、浸润深度和远处转移均无相关性(P>0.05)。见表1。

表1 大肠癌组织中uc.189表达与临床病理特征的相关性

3 讨 论

大肠癌是人类消化系统常见的恶性肿瘤，包括结肠癌和直肠癌。高脂、高蛋白和低纤维饮食是引发大肠癌的易感因素，其他因素包括遗传、大肠炎症、大肠腺瘤等。大肠癌在全世界的癌症发病率中占第3位，在中国则占第5位，并且发病率呈上升趋势，尤其是结肠癌的发病率增长速度迅猛[7-9]。

超保守RNA是长链非编码RNA分子，其碱基序列大于200个。文献[1-3]报道超保守RNA有483个，包括正链DNA 483个和反链DNA 483个[10], 其广泛存在于人、兔、小鼠和大鼠等高等生物中，其DNA序列绝对保守相同。可转录成RNA分子的超保守RNA, 能调控mRNA的转录和翻译，影响蛋白质的合成，同时也能调控其他的RNA分子而影响相关的生物学功能等，从而进一步调控肿瘤细胞的增殖与分化、侵袭转移与预后，参与肿瘤的发生、发展等过程[4-6]。

目前，超保守RNA对肿瘤发生、发展的影响已经成为肿瘤研究的新热点，国外文献[11-16]已对超保守RNA在肺癌、肾细胞癌、肝癌、白血病和胶质瘤等肿瘤中的作用开展了大量的研究。uc.189是383个超保守RNA(UCRs)的一种，其在肝癌组织中高表达[16]。对于uc.189在大肠癌中的研究还未见文献报道，对其在大肠癌中的表达及生物学功能尚不明确。本研究采用qRT-PCR技术发现大肠癌组织中uc.189高表达，约占86.2%(112/130), 而在18例患者中uc.189是正常表达和低表达，证实uc.189在130例大肠癌组织中的表达量显著高于癌旁正常组织中的表达量(P<0.05), 提示uc.189可能是一种新的肿瘤癌基因，极有可能参与了大肠癌的发生、发展过程。本研究结果还表明，大肠癌患者uc.189表达越高，则肿瘤的分化程度越低、淋巴结容易发生转移以及TNM分期越高，提示uc.189表达越高，患者的预后就越差, uc.189的表达在大肠癌的早期诊断和预后评估中具有一定的参考价值。

总之，本研究表明大肠癌中uc.189的表达高于相邻的正常大肠组织，其高表达与大肠癌的分化程度、淋巴结转移和TNM分期密切相关, uc.189可能会作为大肠癌的一种新的肿瘤标志物。