甲型H1N1流行性感冒患者中miRNAs的表达研究

马振莉

流行性感冒(流感)是全世界范围内发病率较高的流行性疾病之一，它是一种甲型流感病毒感染而致的呼吸道传染病。流感病毒分为甲(A)、乙(B)和丙(C)三型[1,2]。其中，甲型H1N1流感病毒变异能力强、危害大，患者通常出现全身酸痛、咳痰、咽痛、发热、胸痛、乏力、鼻塞等流感样症状，少数患者可出现合并呼吸衰竭、肺炎，最终死亡[3]。甲型H1N1流行性感冒主要通过空气飞沫传播和患者分泌物传播，传染性强、发病率高，易在学校、医院、幼儿园等人员密集场所引起暴发流行或大流行[4]。据统计，每几十年或几年就会发生全球性或地区性的甲型流行性感冒，每年有数百万人会发生甲型流行性感冒，给社会经济发展和公共卫生安全带来巨大的威胁[5,6]。目前，临床缺乏诊断、预测和预防甲型流行性感冒的有效方法和指标，因此，本实验研究2017年3月至2018年6月期间于我院就诊的甲型H1N1流行性感冒患者中miRNAs的表达水平，为抵御甲型流感病毒提供新思路。

1.资料与方法

1.1 一般资料 将2016年3月至2018年6月期间于我院就诊的168例患者作为本实验的研究对象，根据原卫生部发布的《甲型HlN1流感诊疗方案(2009年第三版)》甲型HlN1流感的诊断标准及《全国流感监测方案(2010年版)》中流感样病例的诊断标准，将168例患者分为甲型H1N1流感患者组(n=86)和对照组(n=82)。

本研究病例纳入标准：①年龄范围为18～65岁；②发热≥37.5℃；③至少具有两个下列症状：鼻塞、咽喉痛、咳嗽、肌痛、乏力、头痛、寒战或出汗；④自愿参与本课题，并签署书面知情同意书。排除标准：①患有痴呆或其他精神科疾病；②怀孕或哺乳妇女；③实验室检查有细菌感染的高度可能性；④合并心肺、肝肾功能异常、凝血功能障碍或其他先天性重大疾病。

1.2 血清样本的采集 采用EDTA抗凝管收集甲型H1N1流感患者组及对照组人员空腹肘部静脉血4ml，现场编号并详细记录患者姓名和一般情况。随后，12000r/min常温离心10min，将上清液收集于无RNA酶的进口EP管中，置于 -80℃保存，以备提取RNA。此外，在甲型H1N1流感患者接受治疗前及治愈出院时均抽取患者空腹肘部静脉血4ml，同样方法处理血液样品，并保存。

1.3 总RNA提取 血清样本中总RNA的提取采用TRIzol试剂盒(Invitrogen，美国)，按说明书进行操作。取血清标本，加入1ml Trizol试剂，充分混匀，并加入200μl氯仿。振荡混匀，室温静置10min后，置于4℃低温离心机，12500r/min离心15min。将上清液转移至另一EP管中，加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，12000r/min离心10min。弃掉上清，在剩余的RNA沉淀中加入DEPC水。提取的总RNA经Nanodrop仪器(Thermo，美国)检测A260/A280值，当比值在1.8～2.0时可用于后续步骤。

1.4 逆转录和实时荧光定量PCR实验 采用逆转录试剂盒(ABI，美国)将RNA逆转录成cDNA，选择德国罗氏逆转录仪进行该反应。并采用已制备的cDNA、蒸馏水、引物、SYBR试剂(罗氏，德国)进行实时荧光定量PCR操作。反应条件：50℃预热2min，95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火1min，72℃延伸30s，40个循环，记录并统计各个样本的循环数(CT值)。按照2-△△CT法，以U6为内参，检测miRNAs的相对表达变化。本实验中所有引物序列详见表1。

表1 所有引物序列

1.5 统计学方法 所有数据均表示为均数±标准差，采用SPSS 16.0软件对数据进行统计分析。组间比较采用t检验。当P<0.05时，差异具有统计学意义。

2.结果

2.1 两组患者血清中miRNAs的表达水平 收集对照组和甲型H1N1流感患者组血清样本，检测miR-101、miR-196a-5p、miR-203、miR-21、miR-221、miR-24、miR-27a、miR-326、miR-502的表达水平。结果显示，miR-196a-5p、miR-21和miR-221在甲型H1N1流感患者血清中表达升高，差异具有统计学意义(P=0.0376，0.0027，0.0096)，其中miR-21的表达升高最为显著。如图1所示，miR-203、miR-502在甲型H1N1流感患者血清中表达降低，差异具有统计学意义(P=0.0011，0.0050)(图1)，其中，niR-502的表达降低最为显著。此外，miR-101、miR-221、miR-24、miR-27a、miR-326、在对照组和甲型H1N1流感患者血清中无差异性表达。

注：*P<0.05,**P<0.01。图1 两组患者血清中mRNAS的表达对比

2.2 甲型H1N1流感患者治疗前后血清中miRNAs的表达变化 收集甲型H1N1流感患者治疗前及治愈出院时血清样本，进一步检测miR-196a-5p、miR-203、miR-21、miR-221、miR-502在甲型H1N1流感患者接受治疗前后的表达变化。结果显示，miR-196a-5p、miR-203、miR-221、miR-502在甲型H1N1流感患者治疗前后血清中的表达并没有显著差异(图2)。与治疗前相比，miR-21在甲型H1N1流感患者治疗后显著降低，差异具有统计学意义(P=0.0472)，见图2。

注：*P<0.05。图2 甲型H1N1流感患者治疗后血清mRNAS的表达变化

3.讨论

甲型H1N1流行性感冒是一种全世界流行的传染性较强的呼吸系统疾病，目前缺乏早期预测、诊断和治疗的生物指标，且临床缺乏有效的抗流感病毒药物[7]。miRNAs是一种长度约为18～25个核苷酸的非编码小RNA分子，其能够调控靶基因的降解或抑制靶基因的表达，进而参与大多数真核生物生命进程[8]。据报道，miRNAs在宿主与病毒相互作用中发挥了重要作用。因此，我们探讨miRNAs是否可以成为抗流感病毒的新靶点。

本研究通过收集对照组患者和甲型H1N1流行性感冒患者的血清，研究miRNAs在两组患者血清中的表达，发现miR-21在甲型H1N1流行性感冒患者血清中显著升高。进一步研究表明，与治疗前相比甲型H1N1流行性感冒患者治疗后miR-21的表达显著降低，因此miR-21可能与甲型H1N1流行性感冒的发生和发展有密切联系，但其具体机制和作用有待继续研究。

本研究通过检测甲型H1N1流行性感冒患者血清中miRNAs的表达，证明miR-21可能参与甲型H1N1流行性感冒的发生和发展，为早期诊断、预测、预防和治疗甲型H1N1流行性感冒提供新思路。