RUNX3基因甲基化在结直肠癌发生中作用及与预后的关系研究

贾光辉 郭 民

内蒙古自治区乌兰察布市中心医院普外科，内蒙古乌兰察布 012000

结直肠癌（CRC）在全世界范围内均有较高的发病率，位居全省恶性肿瘤第3 位，近些年受多种因素影响我国疾病发病率呈上升趋势，早期有效筛查、诊断疾病对改善患者预后、提高患者生存率有重要意义[1]。RUNX3 基因是近年新发现的一种抑癌基因，其通过参与TGF-β 信号传导调控细胞分化、恶变、凋亡等过程[2]。有研究指出RUNX3 基因表达下调与基因启动子区域甲基化有关，而RUNX3基因表达下降，会导致TGF-β 信号传导抑制，造成细胞凋亡失控，从而促肿瘤生长、转移，其可能成为临床肿瘤预后评估重要指标[3]。本研究通过观察结直肠癌组织、正常黏膜组织RUNX3 甲基化状态，分析基因甲基化与疾病预后的关系，旨在为今后疾病早期诊断提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2012年5月～2013年11月病理确诊为原发性CRC 患者59 例为研究对象，所有患者均行根治性切除治疗，医院伦理委员会审核通过，患者病历资料完整，未合并其他恶性肿瘤，未行放化疗，签署知情同意书。获取患者癌组织、正常黏膜组织（距肿瘤边缘10cm 以上），标本取出后即刻液氮冷却。患者年龄31～69 岁，平均（47.2±5.3）岁，肿瘤直径3.5～7.8cm，平均（5.0±1.3）cm，位置：直肠35 例、结肠24 例。

表1 不同组织RUNX3蛋白表达、甲基化状态[n（%）]

1.2 试剂、仪器

试剂、仪器：DAB 显色试剂盒、鼠抗人RUNX3单克隆抗体（美国Sigma 公司）、免疫组化SP 试剂盒（福州迈新生物技术有限公司）、DNA 提取试剂盒（中山大学达安基因有限公司）、甲基化酶（美国New England Biolabs 公司）、甲基化试剂盒（美国Zymo Research 公司）。

1.3 方法

1.3.1 免疫组化法 在获取观察标本组织后固定（10%甲醛溶液），石蜡包埋、切片（厚度5μm），烘片、脱蜡、脱水，加3%过氧化氢，行抗原高压热修复，加封闭液（山羊血清）室温封闭30min，后加一抗孵育1h（放于湿盒内，在37℃环境下），以PBS冲洗（3 次，5min/次），加二抗覆盖组织后室温孵育（30min），PBS 冲洗，加DAB 显色，苏木精复染、1%盐酸乙醇分化，脱水、透明、树胶封片。

1.3.2 MSP 检测 以DNA 提取试剂盒提取标本组织中DNA，后以甲基化试剂盒对DAN 进行修饰，后构建反应体系（0.5μL cDNA、2.5μL PCR Buffer、1μL 上 下 引 物、2μL dNTP、0.2TapE、16.3μL dd H2O）行定量PCR 扩增，条件：94℃ 5min（预变性）、94℃ 30s（变性）、65.6℃（M 甲基化反应）或61.2℃（U非甲基化反应）30s（退火）、72℃ 55s（延伸）共35个循环。后以2%琼脂糖凝胶电泳检测，自动成像仪照相分析。

引物M，上游：5’TTACGAGGGGCGGTGGTACGCGGG3’，下游：5’AAAACGACCGACGCGAACGCCTCC3’，扩增长度220。

引物U，上游：5’TTATGAGGGGTGGTTGTATGTGGG3’，下游：5’AAAACAACCAACACAAACACCTCC3’，扩增长度234。

1.4 观察指标

观察不同组织中RUNX3 蛋白表达及甲基化状态，所有患者随访5年，分析基因甲基化与疾病预后的关系。本次甲基化状态判断标准[4]：阳性，仅出现甲基化本条带或同时出现甲基化、非甲基化条带；阴性，仅出现非甲基化条带。RUNX3 蛋白表达以阳性细胞数与显色强度乘积评分进行评估[5]：阳性，乘积评分2 分以上，阴性，两者乘积1 分以下；显色强度：无色0 分，浅黄色1 分，棕黄色2 分，棕褐色3 分；阳性细胞数：0 分为阳性细胞率10%以下，11%～29% 计1 分，2 分 为30%～49%，50%以上为3 分。

1.5 统计学分析

本次数据统计学结果采用SPSS19.0 系统进行分析，计量资料以（）表示，采用t检验，计数资料以[n（%）]表示，采用χ2检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同组织RUNX3蛋白表达、甲基化状态

癌组织中RUNX3 蛋白阳性表达为49.15%低于正常组织94.92%，同时RUNX3 甲基化阳性40.68%高于正常组织0，P＜0.05。见表1、图1。

图1 RUNX3 蛋白甲基化状态（Ma 为标记，N 为正常组织，T 为肿瘤）

2.2 RUNX3甲基化状态与CRC预后关系

患者随访5年，其中24 例死亡、34 例存活、1例失访，中位生存时间51 个月，对影响患者存活的临床病理因素进行分析，淋巴结转移、RUNX3 甲基化状态与患者存活有关，P＜0.05，与年龄、分期、分化程度无关，P＞0.05。见表2、图2。

3 讨论

肿瘤形成是一个复杂过程，涉及基因异常表达、饮食等多方面，临床认为表观遗传学、基因序列改变是造成肿瘤发生、发展的重要原因，其中表观遗传学改变多依靠改变基因甲基化状态来实现。有研究表明人体中抑癌基因的异常甲基化会抑制癌细胞凋亡，起到促肿瘤发生，致恶性表型的作用，因此有学者提出通过检测肿瘤患者抑癌基因甲基化状态，从而来判断癌细胞侵润程度、患者预后情况[6-7]。

表2 患者存活的临床病理单因素分析

图2 CRC 者RUNX3 甲基化、非甲基化生存曲线

RUNX3 是近些年临床发现的新型基因，位于染色体lp36.1，全长67kb，其中启动子p2 可控制基因转录，有研究表明RUNX3 蛋白可通过指导TGF-β信号传导，激活Smad 蛋白复合物，使复合物转入特定核内靶点位，从而激活相关靶基因，参与细胞周期调控、恶性转变、分化等过程[8-9]。以往已有学者研究发现RUNX3 基因甲基化与胃癌发生、发展及患者预后相关，此基因甲基化除了在胃癌前病变、早期腺癌形成中发挥重要作用，同时在肺癌、膀胱癌发病中起重要作用[10-11]。但目前有关RUNX3 基因甲基与结直肠癌发生、预后关系的研究较少，故本文对此进行探究分析。本次对CRC 者癌组织、正常组织中RUNX3 蛋白表达及基因甲基化状态进行比较，发现癌组织中RUNX3 蛋白阳性表达为49.15%低于正常组织94.92%，同时RUNX3 基因甲基化阳性40.68%高于正常组织0，P＜0.05，提示CRC 发生可能与RUNX3 异常表达有关，RUNX3 基因甲基化有肿瘤特异性，基因高甲基化可能与CRC发生、发展有关。本次研究中RUNX3 蛋白表达呈下降趋势，而基因甲基化状态表现为升高，提示基因甲基化可能通过阻碍转录因子、DNA 之间相互作用，抑制转录降低RUNX3 蛋白表达，致Smad蛋白功能受限，从而使细胞对正常分化过程的调节失控，癌细胞摆脱TGF-β 作用，进而促癌发生、发展[12-13]。

有学者发现术前血清CRC 甲基化者复发率高于CRC 非甲基化者，RUNX3 甲基化与CRC 肿瘤分期、淋巴结侵润有关，其认为血清RUNX3 基因甲基化可能成为疾病早期诊断、治疗预后判断的重要指标[14]。本研究观察RUNX3 甲基化状态与CRC预后关系，对患者随访5年，5年存活率为57.62%（34/59），绘制CRC 者RUNX3 甲基化、非甲基化生存曲线，发现非甲基化患者累积存活率高于甲基化患者。同时通过对影响患者存活的临床病理因素进行分析，发现淋巴结转移、RUNX3 甲基化状态与患者存活有关，P＜0.05，与年龄、分期、分化程度无关，P＞0.05。结果提示RUNX3 甲基化状态可作为临床判断CRC 患者预后的生物指标，但由于本次研究样本量较小，且正常黏膜组织取自CRC 患者，无法排出正常人的黏膜组织中RUNX3 表达情况，所得结论存在误差，仍有待进一步扩大样本量研究、证实结论[15]。

综上所述，RUNX3 蛋白表达、基因甲基化状态在CRC 癌组织、正常组织中存在差异，RUNX3 基因甲基化状态可能为疾病发生、预后判断提供依据。