200例原发性闭经患者细胞遗传学分析

李显筝 许玲 黎凤珍 蔡婵慧

(广东省妇幼保健院 医学遗传中心，广东 广州 511400)

目前，不孕不育症对生育的影响越来越大，而闭经则是引起女性不孕的第6大因素。原发性闭经是指女性年龄超过14岁、第二性征未发育、从未有过月经，或年龄超过16岁、第二性征已发育，月经仍未来潮，其发病率约0.1%[1]。大部分原发性闭经患者在未进行正规的遗传学评估的情况下就盲目采取了激素补充治疗，而不必要且过量的激素则带来了一系列的临床问题[2]。本文将通过对2013 年1月至2017年12月本院就诊的200例原发性闭经患者行外周血染色体核型分析，进一步了解原发性闭经患者的性染色体异常率及异常核型的种类。

1 对象与方法

1.1 对象 广东省妇幼保健院2013年1月至2017年12月因无月经初潮来本院就诊的200例原发性闭经女性患者，临床表现及社会性别均为女性表型，且尚未用药治疗。

1.2 方法 签署知情同意书后，无菌注射器抽取肝素抗凝外周血3 ml，取0.5 ml接种于淋巴细胞培养基内，37 ℃恒温箱培养72 h，培养完成前2 h加浓度为100 μg/ml的秋水仙素25 μl后，继续培养12 min，取培养液以1 500 rmp离心6min，弃上清，加入预温至37 ℃的低渗液(0.075 mol/L KCl溶液)6 ml，于37 ℃水浴30 min，加2 ml新鲜配制的甲醇、冰醋酸固定液(3∶1)，轻轻混匀，以1 500 rmp离心6 min，弃上清，加入新配固定液约5 ml，离心，按以上方法再固定一次，弃上清，将沉淀调成细胞悬液进行滴片。60 ℃烤箱烤16h。自然冷却后，常规G显带，Zeiss染色体核型扫描分析系统扫描，计数20个中期分裂相，分析至少5个核型；嵌合体病例计数至少100个中期分裂相。染色体多态性如9号染色体臂间倒位、着丝粒异染色质区变异、随体变异等均详细描述，并归入正常染色体核型。按照人类细胞遗传学国际命名体制(ISCN2013)的标准命名核型。

2 结果

200例原发性闭经患者，平均年龄约为20岁，其中检出50例性染色体异常，异常核型比例25%。其中X染色体数目异常16例、占8% ；X染色体结构异常8例，占4% ；X染色体数目伴结构异常15例，占7.5%，含Y染色体11例，占5.5%。(见表1)

表1 200例原发性闭经患者外周血染色体核型分析结果及临床表现

3 讨论

原发性闭经发病原因复杂多样，约20%～40%的原发性闭经患者存在性染色体异常。本研究发现原发性闭经患者性染色体的异常率为25%，进一步证实性染色体异常是原发性闭经的重要原因之一。

3.1 X染色体数目异常与原发性闭经 本研究共检出核型为45,X 12例，及45,X嵌合型1例。45,X(Turner综合征)的产生原因主要是在生殖细胞减数分裂过程中X染色体的不分离。Lyon假说认为：①哺乳动物的正常雌性细胞中，有一条X染色体是处于失活状态的；②失活是随机的，可能来自父母任意一方；③失活发生在胚胎发育早期，一旦发生，其子细胞中将保持恒定失活。X染色体失活可能是45,X能够存活的一个重要原因。但是，失活的X染色体上有部分基因是逃逸基因，这些逃逸基因在生长发育的调控中发挥重要作用，如位于X染色体的短臂末端区域的SHOX[3]基因，其剂量上的减少是导致45,X患者身材矮小的主要原因。典型的45,X表现为Turner综合征，其特点为出生时低体重，身材矮小，性腺发育不全，闭经，蹼颈，后发际低，肘外翻等。同单纯的45,X相比，45,X嵌合型的患者临床表现会有不同程度的减轻，其表型和性腺分化程度取决于分化过程中体细胞和生殖细胞中45,X与正常细胞的比例，正常细胞的比例越高越接近正常人的表型。

3.2 X染色体结构异常与原发性闭经 本研究共检出X染色体结构异常8例，其中4例为X长臂等臂染色体，1例X双着丝粒染色体，3例X染色体与常染色体易位。X染色体失活及逃逸现象，是我们认识涉及X染色体的性发育异常患者不同临床表现的遗传理论基础。根据Lyon假说，当X染色体与常染色体发生易位时，大多数情况下是正常的X染色体优先失活，从而患者为平衡易位携带者，表型上无异常。而实际上，本文中的3例X染色体与常染色体易位患者虽然表型上无明显异常，但也出现了不同程度的发育问题。究其原因，可能是正常的X染色体失活的位置效应，也可能是X染色体断裂重接处发生了部分基因的缺失。

3.3 X染色体数目伴结构异常与原发性闭经 本研究检出的X染色体数目伴结构异常病例中，均为异常X染色体与45,X的嵌合体，各自嵌合比例不同导致其表型不同。若45,X核型在体细胞和生殖细胞中所占比例较高，则表型更倾向于Turner综合征的表型。若异常X核型在体细胞和生殖细胞中所占比例较高，则因不同区段承载的基因不同，缺失、易位导致的症状也不同。

Wyss等[4]曾绘制了X染色体假定基因位置的模式图，提示决定性腺发育的基因位于X染色体的短臂Xp11-Xpter区域以及长臂Xq27-q28区域，而决定躯体正常发育的基因位于Xp11-Xp12和Xq21-Xq26区域。而Xql3-Xq27则是卵巢发育和功能维持的关键区域[5]，卵巢早衰的相关致病基因如FMR1、DIAPH、POFlB等均位于该区域内[6]，当X染色体与常染色体发生易位，断裂点在这两个功能区中时，可导致卵巢早衰，卵巢体积小或成条索状。本文中有一例X与16号染色体易位，其X断裂点位于Xq13.1，患者出现了卵巢早衰的症状。当X染色体长臂缺失，由于断裂点正好在卵巢关键区域内，因此患者会出现原发闭经，卵巢发育不良，激素水平异常等症状，而这些患者由于X短臂未缺失，身高多表现正常[7]。

3.4 46,XY性反转综合征与原发性闭经 本研究共检出11例核型为46,XY的女性原发性闭经患者，此类患者属于性反转综合征。性反转综合征主要涉及生殖发育异常，主要表现为性腺、性别与染色体核型不相符，临床表现为女性外观、性腺条索状、女性幼稚型外阴、阴蒂肥大、阴道短浅且为盲端、第二性征发育差、出现喉结等男性体征、睾丸不发育、两性畸形等。目前导致该病的原因主要有以下几种假说：①Y染色体上的SRY基因突变或缺失[8]，SRY是男性性别决定基因，位于Y染色体短臂区域，对睾丸的形成具有关键作用，因此，SRY基因的突变可导致46,XY女性的形成；②SOX9基因突变[9]：SOX9基因被称为躯干发育异常基因，SOX9突变可破坏蛋白质结构和功能，导致46,XY个体的性反转和躯干发育异常；③其他性别决定相关基因突变：性别决定和分化是一个以SRY基因为主导的、多基因参与的有序协调表达过程，其中某一基因的突变就可能导致性反转的发生；④患者存在未检出的46,XX/46,XY嵌合体：因目前染色体核型分析多采用静脉血，难以发现内、外、中胚层间的嵌合体，若性腺组织中存在46,XX/46,XY真性嵌合体，其生殖腺发育则会出现两性畸形。目前认为SRY基因的突变和缺失是导致46,XY女性性反转的主要原因。

同时，有学者认为携带Y染色体或其来源序列的女性患者，其发生性腺母细胞瘤和无性细胞瘤的风险约为30%～75%，因此该类患者需定期检查，一旦发现患病应及时手术治疗[10]。

3.5 染色体微小缺失、重复与原发性闭经 本研究中的200例原发性闭经患者，核型为46,XX 的患者有150例，占受检总数的75%。染色体核型虽然正常，但染色体上可能存在某种微小的缺失、重复或易位，或者某个基因的缺陷，有待在分子水平上进一步研究。国外有学者用比较基因组杂交技术对染色体核型正常的卵巢早衰患者进行检测，发现有部分患者存在性染色体微缺失[11]。因此，对于染色体核型正常的原发性闭经患者，有必要进一步行比较基因组杂交检测，以排除染色体微缺失、微重复的可能性。

综上所述，性染色体异常是导致原发性闭经的主要原因之一。对于该类患者应及时行细胞遗传学检测，通过染色体核型分析鉴定，对核型正常但表型异常的患者需进一步采用比较基因组杂交等分子水平检测，以排除微小缺失、重复等。尽量做到早发现早治疗，从而降低生殖腺恶变，减少患者的心理负担，提高患者的生活质量。