HPLC法同时测定不同产地龙胆酒炙前后3种环烯醚萜苷

2019-06-03孙建之徐士钊曹丽娟姜恒丽

中成药 2019年5期

吕新，孙建之，徐士钊，才谦∗，曹丽娟，姜恒丽

（1.辽宁中医药大学药学院，辽宁大连 116600；2.盛实百草药业有限公司，天津 300301）

龙胆为龙胆科植物条叶龙胆Gentiana manshuricaKitag.、龙胆Gentiana scabraBge.、三花龙胆Gentiana trifloraPall.或坚龙胆Gentiana rigescensFranch.的干燥根及根茎。前3种习称龙胆，后 1种习称坚龙胆［1］。龙胆的生长范围广泛，遍布于黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古、浙江、江苏、广东、云南、新疆等地。其主要成分为环烯醚萜苷类，以含有量较高的龙胆苦苷、獐牙菜苦苷和獐芽菜苷为代表［2-7］。历史上记载龙胆的炮制方法有很多，如酒龙胆、龙胆炭、胆汁制龙胆、蜜龙胆、姜龙胆等［8-10］，目前广泛应用的是生龙胆和酒龙胆。药材经过酒制后，发生了物理和化学变化，会导致药性缓和或改变［11-13］。传统理论认为酒炙以热制寒，可缓和生龙胆苦寒之性及引药上行［14］。采用HPLC 法对22 个不同产地的生龙胆和对应的自制酒龙胆中3种成分进行含有量测定，并比较酒炙前后含有量差异。

1 仪器与材料

1.1 仪器高效液相色谱仪Angilent1100、SPD-l0A 紫外检测器（美国安捷伦公司）；GTSONICP13 型超声波清洗器（江苏苏州江东精密仪器有限公司）；CP225D 型电子天平（十万分之一，北京赛多利斯仪器系统有限公司）。

1.2 材料龙胆饮片收集于不同产地，见表1，由辽宁中医药大学鉴定教研室李峰教授进行鉴定为正品；酒龙胆为自制（方法参考2015年版《中国药典》Ⅰ附录ⅡD 酒炙法）。黄酒（浙江塔牌绍兴酒有限公司，产品标准号GB／T17946）。龙胆苦苷、獐牙菜苦苷和獐芽菜苷对照品均购自江苏永健医药科技有限公司，含有量均≥98%；甲醇（色谱级，天津市大茂化学试剂厂）；纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。

2 方法与结果

2.1 吸收波长确定将药材提取液进行紫外全波长扫描，龙胆苦苷在270 nm 处有明显吸收峰，而獐牙菜苦苷和獐芽菜苷较差；在240 nm 处3种成分都有明显吸收，故检测波长为240 nm。

2.2 色谱条件 Welchrom C18柱（4.6 nm×250 mm，5 μm）；流动相甲醇（A）-水（B），梯度洗脱（0～25 min，8%～45%A；25～35 min，45%～48%A；35～45 min，48%～65%A；45～50 min，65%～90%A）；检测波长240 nm；体积流量1.0 mL／min；柱温 25 ℃；进样量 20 μL。

2.3 对照品溶液制备精密称取适量的龙胆苦苷、獐牙菜苦苷和獐芽菜苷对照品，放置在10 mL量瓶中并加甲醇至刻度处，制得3种成分混合对照品溶液。质量浓度分别为 2、0.2、16 μg／mL。

2.4 供试品溶液制备将22 批不同产地的生、酒龙胆粉末过60 目筛，分别取0.5 g，精密称定，加入甲醇 20 mL，记录质量，放入超声仪器中，30 min后放冷再称定质量，用甲醇补足减失质量，过滤定容至 25 mL 量瓶中，滤液经 0.45 μm 微孔滤膜过滤，即得，避光，置于冰箱中4 ℃备用。

2.5 方法学考察

2.5.1 系统适用性试验取辽宁清原生、酒龙胆制备的供试品溶液和混合对照品溶液，在 “2.2”项色谱条件下进样测定，见图1。龙胆苦苷、獐牙菜苦苷和獐芽菜苷的色谱峰与相邻色谱峰的分离度均符合要求，与其他组分完全分离。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.5.2 线性关系考察取龙胆苦苷标准品20.00 mg，且精密称定于10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度线处制成2.0 mg／mL 对照品贮备液。精密吸取龙胆苦苷对照品贮备液加甲醇制成质量浓度分别为 0.062 5、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 mg／mL的溶液，摇匀。质量浓度从低到高分别精密吸取20 μL，在 “2.2”项色谱条件下进样，以化合物进样量为横坐标（X），色谱峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归，得回归方程为Y=930.39X-127.68（r= 0.999 5），表明龙胆苦苷在 1.25～40 μg范围内线性关系良好。

另称取獐牙菜苦苷标准品12.5 mg，且精密称定于 25 mL 量瓶中，加甲醇至刻度线处制成500 μg／mL的对照品贮备液。分别精密吸取獐牙菜苦苷对照品贮备液加甲醇制成质量浓度分别为12.5、25、50、100、150、200 μg／mL 的溶液，摇匀。质量浓度从低到高分别精密吸取 20 μL，在“2.2”项色谱条件下进样，以化合物进样量为横坐标（X），色谱峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归，得回归方程为Y= 1 391.1X-121.48（r=0.999 2），表明獐牙菜苦苷在0.25～4 μg 范围内线性关系良好。

另称取獐芽菜苷标准品1.60 mg，且精密称定于100 mL 量瓶中，加甲醇至刻度线处制成16 μg／mL的对照品贮备液。精密吸取獐芽菜苷对照品贮备液加甲醇制成质量浓度分别为0.5、1、2、4、8、16 μg／mL 的溶液，摇匀。质量浓度从低到高分别精密吸取20 μL，在 “2.2”项色谱条件下进样，以化合物进样量为横坐标（X），色谱峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归，得回归方程为Y=1.903 5X-1.322 4（r=0.999 8），表明獐芽菜苷在10～320 ng 范围内线性关系良好。

2.5.3 精密度试验取辽宁清原生龙胆粉末，按“2.4”项下方法制备供试品溶液，在 “2.2”项色谱条件下连续进样5 次且每次20 μL，龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、獐芽菜苷峰面积积分值的RSD 分别为 0.81%、0.52%、0.77%，表明该仪器精密度良好。

2.5.4 稳定性试验取辽宁清原生龙胆粉末，按“2.4”项下方法制备供试品溶液，在 “2.2”项色谱条件下，分别于 0、4、8、12、24、48 h 进样分析并计算其3种成分含有量。结果龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、獐芽菜苷的RSD 分别为1.07%、0.68%、1.27%，表明供试品溶液在48 h 内稳定性良好。

2.5.5 重复性试验取辽宁清原生龙胆粉末5 份，按 “2.4”项下方法制备供试品溶液，在 “2.2”项色谱条件下进样并计算5 份供试品中龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、獐芽菜苷含有量。测得平均值分别为23.58、1.86、0.49 mg／g，RSD 分别为 0.66% 、0.92%、0.84%，表明该方法重复性良好。

2.5.6 加样回收率试验取已知含有量的龙胆样品粉末 0.5 g，精密称定，共 9 份，每 3 份加入高、中、低3 个质量浓度梯度对照品溶液，其加入对照品量与供试品中量的比例分别为1.5 ∶1、1 ∶1、0.5 ∶1，按 “2.4”项下方法制备供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下分别进样并计算。得龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、獐芽菜苷平均加样回收率分别为100.26%、99.84%、100.17%，RSD 分别为1.32% 、1.59% 、1.16% 。

2.6 样品含有量测定将不同产地生品和炮制品龙胆样品溶液，在 “2.2”项色谱条件下测定，并计算，结果见表1。

3 讨论

本实验建立HPLC 法同时测定龙胆饮片中3种成分的含有量，分别考察了乙腈-水和甲醇-水2种流动相体系。结果表明乙腈-水溶液作流动相时，3种成分不能很好分离，存在较大杂峰干扰獐芽菜苷，而甲醇-水溶液分离较好，也无杂峰干扰。

实验中收集了22 个产地的商品生龙胆饮片，因品种和产地有所不同，可能在各样品之间化学成分的种类和含有量有一些差异，故本实验选择了龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、獐芽菜苷作为指标性成分进行含有量测定并比较［15-18］。结果表明，不同产地样品中3种成分的含有量存在明显差别，辽宁新宾的龙胆苦苷含有量高达65.875 mg／g，而西藏拉萨此成分含有量最低，为4.217 mg／g；辽宁新宾的獐牙菜苦苷含有量也高于其他产地，为3.170 mg／g，而宁夏银川在该成分的含有量则为0.285 mg／g；辽宁清原的獐芽菜苷最高，为 0.484 mg／g，西藏拉萨该成分的含有量最低，为0.069 mg／g。

通过HPLC 法测定不同产地的商品生龙胆和相应酒炙饮片中3种成分的含有量，结果表明，大多数产地龙胆酒炙后龙胆苦苷含有量增加，但酒炙后獐牙菜苦苷和獐芽菜苷含有量变化不一致，一些产地的饮片经过黄酒炮制后含有量上升，还有一些产地含有量下降。推测龙胆酒炙后龙胆苦苷含有量增加的原因可能是经炮制后发生了一系列的化学变化，使该成分含有量增加，也可能是酒炙促进了其溶解；而龙胆酒炙后其他2种成分含有量变化不一的原因尚无法做出科学解释。这3种成分酒炙后含有量发生改变的原因都有待深入研究。