左金丸活性成分-靶点-多维作用机制

李跃文，刘志强，易增兴，秦后响，王博龙

（宜春学院化学与生物工程学院，江西 宜春 336000）

左金丸始载于元代著名医家朱震亨所撰 《丹溪心法》，由黄连、吴茱萸用量按6 ∶1 比例组成，以水丸或汤剂入药，具有清肝泻火、降逆和胃、开郁散结等功效，临床大多用于胃炎、食道炎、胃溃疡等属肝火犯胃者。现代药理研究［1-4］发现，左金丸中黄连、小檗碱可显著诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞的信号转导；小檗碱起到质子泵抑制剂，即H＋／K＋-ATP 酶抑制剂的作用，从而抑制胃酸分泌；小檗碱、吴茱萸次碱直接拮抗胆碱受体或抑制胆碱酯酶的活性，具有抑制小鼠胃肠道蠕动的作用，还可抑制炎症细胞因子的产生和分泌，从而发挥抗炎作用，故该制剂临床应用也扩展到肿瘤、炎症等疾病的治疗［5］。然而，左金丸主要药效成分、靶标、通路，以及治疗不同疾病的分子机制迄今仍不清楚。

网络药理学是以系统生物学、多向药理学为理论基础，通过构建药物-靶点-疾病之间的复杂网络来探讨药物作用机制，其研究方法的整体性、系统性非常适合于研究多组分、多靶点的中药及其复方，为挖掘中药药效物质及其作用机制，阐述复方配伍规律及一方多效提供了新的途径与方法［6-8］，已成为中药及其复方研究中的热点［9］。本研究借助网络药理学方法，探索左金丸主要药效物质基础与靶标、疾病的相互作用关系，以期系统、全面地阐述其机制。

1 资料与方法

1.1 中药活性成分收集与筛选 通过中药系统药理学分析平台TCMSP 数据库收集左金丸中黄连、吴茱萸的主要化学成分，以 OB ＞30%、DL ＞0.18作为其活性成分筛选条件。其中，口服生物利用度（OB）指的是药物有效成分或活性基被吸收到达体循环并被吸收的速度与程度，类药性（DL）指的是药物包含一些特定功能基团或具有与大多药物相同或相似的物理特征，两者为中药成分吸收、分布、代谢、排泄（ADME）的关键参数。同时结合文献最终确定左金丸活性成分。

1.2 左金丸活性成分-靶点网络构建及靶点-疾病网络构建 TCMSP 数据库提供了潜在活性分子的靶点（包括Drugbank 数据库中6 511 个药物分子、3 987 个与已知化合物相互作用的蛋白质），通过该数据库提取活性成分的作用靶蛋白，UniProt、GeneCards 数据库筛选出物种为 “人”的对应靶基因，从而获得其活性成分的对应靶基因。然后，运用Cytoscape 软件将TCMSP 数据库筛选出的左金丸活性成分与其潜在靶点构建 “左金丸活性成分-靶点”网络图，“Network Analyzer”插件分析该网络图的拓扑属性，依据其 “节点度值分布、介数中心性”2 个重要网络拓扑参数来筛选左金丸主要活性成分。

1.3 左金丸靶点-疾病网络构建 通过TTD 数据库找寻左金丸靶点潜在治疗疾病，Cytoscape 软件构建左金丸靶点-疾病网络图。

1.4 蛋白互作（PPI）网络构建 将左金丸靶蛋白导入 STRING 数据库，将蛋白种类设置为“Homo sapiens”后进行操作，最低相互作用阀值设为中等 “medium confidence”，其余参数均保持默认，构建左金丸靶蛋白之间的相互作用网络（PPI network），结果保存成TSV 格式并导入 Cytoscape，再利用 “Network Analysis”功能进行网络的拓扑属性分析，将度值、介数均排序在前20 的靶蛋白建立交集，筛选左金丸关键靶蛋白。

1.5 GO 生物过程与KEGG 通路富集 利用Cytoscape 软件中的 “BiNGO”插件对左金丸靶基因进行GO 生物过程富集，并应用 “MCODE”插件对所有具有统计学意义（P-value＜0.05）的 GO 生物过程进行聚类分析，并对各子簇进行注释；利用DAVID6.8 平台对左金丸进行KEGG 通路富集，设定阈值P-value＜0.05，研究相关靶点参与的主要信号通路。

2 结果

2.1 活性成分筛选 依据DL＞0.18、OB＞30%的原则，在TCMSP 数据库中筛选出11种活性成分，另外黄连中药根碱、非洲防己碱OB 值虽然相对较低，但文献［5，10-11］报道两者也是该药材活性物质，最终筛选出 13种，见表1。

表1 左金丸中活性成分Tab.1 Active ingredients in Zuojin Pills

2.2 活性成分-靶点分析 以左金丸中13种活性成分和49 个靶点构建活性成分-靶点网络图（图1），各节点度值、介数中心性分布见图2～3，可知两者平均值分别为6、0.02。由图1 可知，吴茱萸次碱、药根碱、吴茱萸碱、非洲防己碱、小檗碱、巴马汀6种成分的度值、介数均超过了平均值，可能是左金丸中活性成分，见表2。

图1 左金丸活性成分-靶点网络Fig.1 Active ingredients-targets network of Zuojin Pills

图2 度值分布（Ⅰ）Fig.2 Degree value distribution（Ⅰ）

2.3 靶点-疾病网络分析 以左金丸具有疾病治疗作用的32 个靶点构建靶点-疾病网络图（图4），可知在消化、神经、心血管系统疾病，以及炎症、癌症等方面具有治疗价值，呈现出多维药理作用。

图3 介数中心性分布（Ⅰ）Fig.3 Betweenness centrality distribution（Ⅰ）

2.4 靶点PPI 网络分析 将左金丸49 个靶蛋白在STRING 平台进行PPI 网络分析，发现有47 个节点蛋白（2 个靶蛋白未参与蛋白互作），207 条相互作用连线，其度值、介数中心性分布见图5～7。再将两者均排序在前20 的靶蛋白建立交集，筛选出度值高、介数大者有 15 个，见表3，可知它们是PPI 网络中的关键节点，即为左金丸发挥药理作用的关键靶点。

图4 左金丸靶点-疾病网络Fig.4 Targets-diseases network of Zuojin Pills

表2 活性成分拓扑参数Tab.2 Topological parameters for active ingredients

2.5 GO 生物过程富集 应用 “BiNGO”插件对49 个靶点进行GO 生物过程富集，最终得到P＜0.05 的 GO 条目 1 092 个，再通过 “MCODE”插件进行聚类分析，结果见表4，共发现炎症反应调节、一氧化氮生物合成与代谢、突触传递、细胞周期与分化、前列腺素合成与代谢等19 个主要子簇。

图5 靶蛋白PPI 网络Fig.5 PPI network of target proteins

2.6 KEGG 信号通路分析 将左金丸49 个靶基因在KEGG 信号通路富集，以P＜0.05 为标准筛选，得到22 条主要信号通路，包括3 条消化液分泌相关通路，消化液分泌、胃酸分泌、胰腺分泌；5 条癌症相关通路，癌症通路、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、膀胱癌；2 条内分泌通路，雌激素信号通路、甲状腺激素信号通路；3 条神经递质相关通路，5-羟色胺能神经突触、神经活性配体受体相互作用信号通路、胆碱能突触；1 条炎症通路，肿瘤坏死因子信号通路；4 条信号转导通路，PI3K-Akt 信号通路、cAMP 信号通路、钙信号通路、T 细胞受体信号通路；4 条心血管通路：心肌细胞肾上腺素能信号、血管平滑肌收缩、血管内皮生长因子信号通路、血小板激活。见表5、图8。

图6 度值分布（Ⅱ）Fig.6 Degree value distribution（Ⅱ）

图7 介数中心性分布（Ⅱ）Fig.7 Betweenness centrality distribution（Ⅱ）

表3 关键靶点与拓扑参数Tab.3 Key targets and topological parameters

表4 子簇注释及中心GO 条目Tab.4 Sub-cluster comments and central GO entries

续表4

续表4

表5 KEGG 信号通路Tab.5 KEGG signaling pathways

图8 KEGG 信号通路富集Fig.8 Enrichment of KEGG signaling pathways

3 讨论

本研究利用TCMSP 数据库筛选得到左金丸13个活性成分及49 个对应靶点，并构建左金丸活性成分-靶点、靶点-疾病、PPI 网络，发现吴茱萸次碱、药根碱、吴茱萸碱、非洲防己碱、小檗碱、巴马汀 6种成分，以及 ESR1、TNF、AR、NOS3、PTGS2、CDK2、MMP9、MMP2、NOS2、IL4 等 15个靶点的度值、介值均较靠前，可能是左金丸主要药效物质及其关键作用靶点。左金丸中小檗碱、巴马汀、黄连碱、甲基黄连碱、药根碱、表小檗碱、吴茱萸碱、吴茱萸次碱等生物碱具有减少胃酸分泌、促进溃疡愈合的作用［12］，与本研究预测得到的主要药效物质，以及疏肝泻火、和胃止痛的功效主治基本一致，其中吴茱萸次碱不仅能抗胆碱能神经，抑制胃肠道运动亢进，还可抑制环氧合酶2（COX-2）的活性或花生四烯酸释放，减少炎性介质前列腺素 E（PGE）的合成而抗炎［13］；吴茱萸碱可通过抑制 NF-κB（p65）蛋白表达，降低 TNF-α 水平，从而发挥肠黏膜保护作用［14］；小檗碱则可显著抑制 IL-6、TNF-α 分泌，减轻由内脂素诱导的人脐静脉内皮细胞损伤，并改善肥胖小鼠胰岛素抵抗和糖代谢异常［15-16］。周祥羽等［17］发现，左金丸能显著升高胃热证大鼠血清中IL-10、B 细胞淋巴瘤因子 2（Bcl-2）水平，降低 IL-2、IL-6、IL-1β、NO 水平，从而减少胃热证大鼠胃黏膜损伤面积；易文等［18］报道，左金丸可通过抑制肝郁脾虚型溃疡性结肠炎患者分泌 NOS2、NO、TNF-α、IL-1β 等促炎因子，促进其分泌 IL-4、IL-10 等抗炎因子，从而恢复促炎因子和抗炎因子之间的平衡，与本研究中GO 生物过程、KEGG 信号通路富集显示左金丸参与NO 生物合成和炎症反应的调节相吻合；尹抗抗等［19］指出，左金丸能明显抑制胃酸分泌，提高胃液pH 值，降低胃溃疡指数，从而抑制大鼠应激性胃溃疡的发生；林科名等［20］研究表明，左金丸乙醇提取物还能降低应激性胃溃疡大鼠脑组织中去甲肾上腺素（NE）、5-羟色胺（5-HT）、多巴胺及肾上腺组织中NE 等单胺神经递质浓度，通过神经体液途径发挥抗应激性胃溃疡的作用；本研究中KEGG 信号通路富集显示左金丸不仅作用于胃酸分泌、胰腺分泌、消化液分泌信号通路，影响整个消化道腺体分泌，还参与5-羟色胺能神经突触、胆碱能神经突触、神经活性配体受体相互作用信号通路等神经递质、胃肠道递质信号通路，这可能是其抑制胃酸、胰液等消化液分泌，促进溃疡愈合，调节胃肠蠕动，治疗中医之脘胁疼痛，口苦嘈杂，呕吐酸水的肝火犯胃证，以及西医多种胃炎、胆囊炎、消化性溃疡、功能性消化不良等［21-22］胃肠疾病的药理基础。

左金丸靶点KEGG 富集集中的另一个领域是癌症，主要有癌症通路、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、膀胱癌5 条，表明它在癌症治疗方面具有潜在价值。目前已确认的抗癌活性成分有小檗碱和吴茱萸碱［10］，其中前者不仅抑制 EGFR、ERBB2、FGFR1、MET、VEGFR2 等多个酪氨酸激酶受体激活，诱导癌细胞凋亡或周期停滞，抑制癌细胞生长及转移，增强肿瘤细胞化疗敏感性，还能调控 P13 K／AKT 通路，抑制 MMP2、MMP9 表达，有效降低肺腺癌细胞A549 细胞、膀胱癌T24 细胞的迁移侵袭能力，从而产生肿瘤防治作用［23-27］；后者可通过调节M 期阻滞与滑移，上调a-SMase 表达，诱导人胃 癌 SGC-7901 细胞凋亡［28］。杜 佳等［29］发现，左金丸含药血清可通过调节乳腺癌细胞 CDK2、CDK4、Cyclin D1、Cyciln E 等周期相关蛋白，阻滞细胞周期进程，诱导细胞凋亡，进而抑制乳腺癌细胞增殖，与本研究中左金丸GO 富集得到细胞周期、细胞凋亡等生物子簇相吻合。

另外还发现，左金丸能作用于心肌细胞肾上腺素能信号、血管内皮生长因子、血小板激活等心血管相关信号通路，表明其具有治疗心血管疾病的潜在价值。林晶晶等［30］报道，吴茱萸碱、吴茱萸次碱具有降血脂、抗动脉粥样硬化、调节血压、保护心脏等心血管药理作用；小檗碱不仅能抑制血小板聚集，减少血液黏稠度，抑制血栓形成，预防心脑血管疾病，还可减少心肌细胞膜上的α 肾上腺素受体数，抑制心肌细胞钙内流，阻断细胞凋亡，从而保护心肌细胞［31-33］。

综上所述，本研究采用网络药理学方法研究左金丸，阐述了其治疗消化系统疾病、癌症、循环系统疾病的活性成分、靶点、多维作用机制，为今后相关研究提供思路与线索，也为拓展该制剂临床应用奠定理论依据。